基于網絡藥理學預測大黃芩魚散清熱解毒藥效物質基礎及作用分析

張文娟， 王宏軍， 蔣 紅， 苗 莎， 孫文杰， 鄭心鈺

（錦州醫科大學畜牧獸醫學院，遼寧錦州 121001）

大黃芩魚散由大黃、黃芩、魚腥草3 味藥材組成，具有清熱解毒之功效，收錄于2020 版《中國獸藥典》二部，主治魚蝦類細菌性爛鰓病，同時還可有效的預防和治療各種鰻魚疾病。 該方中大黃具有清熱解毒、活血祛瘀、促食欲、助消化的作用，黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒之功，魚腥草具有清熱解毒、 利尿除濕和清熱止痢的功效。 張蓉等（2019）、李虹穎等（2020）對大黃芩魚散進行了相關的研究， 而目前對其具有清熱解毒功效的物質基礎及其多重成分、多個靶點、多條途徑的網絡調節機制鮮見報道。 Hopkins （2008）、 韓彥琪等（2016）提出網絡藥理學是可以揭示藥物、靶點及疾病間復雜的生物網絡關系的學科， 可以從分子水平、基因水平進行分析，預測化學成分對不同靶點、細胞和器官產生作用的行為，從而對化學成分的藥理作用及作用機制做出系統地預測和揭示，有助于快速篩選先導化合物。 鐘仁興等（2020）指出運用網絡數據庫可以獲悉擬研究中藥材的化學成分和藥效來構建“成分-靶點”網絡，可有效地預測中草藥及其復方制劑發揮藥效的成分及其作用機制。 因此，本研究采用網絡藥理學方法，對大黃芩魚散中多個化合物構建了“化合物-靶點”網絡， 預測了大黃芩魚散清熱解毒的藥效物質基礎和作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器 中草藥系統藥理學數據 庫 與 分 析 平 臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）；UNIPROT 數 據 庫（http://www.uniprot.org/）；Swiss Target Prediction 服 務 器（http://new.swisstargetprediction.ch/）；Cytoscape 3.2.1 軟件，The Cytoscape Consortium 提供。

1.2 目標化合物獲取原則 （1）必須是大黃芩魚散中發揮藥效的主要成分；（2）在相關中草藥眾多成分中， 為主要有效成分且能夠口服吸收進入血液循環，設定口服吸收（OB）值大于等于30 的成分進行研究；（3）兼顧藥材中含量較多的、有活性的代表性化合物。因此，在本網絡藥理學試驗研究中， 根據以上三個原則、TCMSP 提供數據， 從大黃、黃芩、魚腥草中分別選取一些化合物，共計34個關鍵化合物為該方法的研究對象（表1）。

表1 大黃芩魚散主要活性成分

1.3 目標化合物靶點的預測 在TCMSP 數據庫檢索，獲取魚腥草、黃芩、大黃相關靶點信息，利用Swiss Target Prediction 服務器查找補充相關靶點信息，并整合二者得到相關的靶點。 由于檢索到的藥物靶標存在命名不規范等問題，利用UniProt 數據庫中UniProtKB 搜索功能，將搜索到的所有靶點校正為其官方正名，實現一致化，并編寫英文縮寫。

1.4 “化合物-靶點”網絡構建 基于上述，獲得大黃芩魚散34 個重要化學成分的靶點結果，利用Excel 表創建化合物-靶點的相互對應關系， 隨后用Cytoscape 3.2.1 軟件構建網絡， 并運用其中的插件Network Analyzer 計算網絡的特征。 網絡中節點（node）表示化合物、靶點，邊（edge）表示化合物-靶點間相互作用。 經軟件處理相關數據后，獲得大黃芩魚散“化合物-靶點”之間的相互關系預測（圖1）。

2 結果

2.1 化合物潛在靶點分析結果 圖1 所示為Cytoscape 3.2.1 軟件構建的34 個化合物與80 個相關靶點相互作用關系（PPI）網絡圖。經分析發現，處于大黃芩魚散PPI 網絡中心的8 個靶點蛋白（表2） 即前列腺素G/H 合酶2 （PS2）、 二肽基肽酶4（DP4）、熱休克蛋白90（HSP90）、雄激素受體（ANDR）、前列腺素G/H 合酶1 （PS1）等度值較高，表示有較多相互作用關系， 判定這8 個靶點為核心靶點，篩選的靶點與免疫調節、炎癥反應、中樞神經系統等方面有關，提示大黃芩魚散發揮清熱解毒藥效的主要化合物與這些蛋白有密切關系。

2.2 “化合物-靶點”網絡構建 圖1 中方形表示化合物，圓形表示靶點，線條表示相互作用，顏色越淺表示相互作用越多。 利用Cytoscape 3.2.1 軟件自帶的Network Analyzer 分析獲得該網絡有114 個節點 （包括34 個化合物、80 個靶點） 和1330 條邊。 網絡拓撲學結構分析顯示，網絡平均度值為11.667，其中大于平均度值的化合物有25個，分別為黃酮類化合物山奈酚、漢黃芩素、山姜素、 千層紙素A、 蘆薈大黃素、5，2’-二羥基-6，7，8-三甲氧基黃酮、金合歡素、黃芩新素、（-）-兒茶素水合物、 蘆丁、 黃芩苷、5，7，8-三羥基黃酮、5，7，4’-三羥基-8- 甲氧基黃酮、5，2’，6’-三羥基-7，8-二甲氧基黃酮、黃芩黃酮I、5，7，2，5-四羥基-8，6-二甲氧基黃酮， 甾醇類化合物β-谷甾醇、α-波菜甾醇，木質素類化合物丹參素，有機酸類化合物大黃酸， 其他類化合物左旋乙酸冰片酯、澤蘭黃醇、決明內酯、hemo-sol、D-camphene；靶點有24 個，除了表2 中的8 個關鍵靶點外，還有雌激素受體（ESTR）、鈣調蛋白（CAL）、蛋白激酶A 催化亞基C-α 的mRNA（PCS）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Chk1）、糖原合成酶激酶（GSK3）、細胞分裂蛋白激酶2 （CDPK2）、γ-過氧化物酶體增殖物活化受體（PPAR）、原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（PSK）、細胞周期蛋白（Cyc-A2）、鈉通道蛋白5 型亞基（SCP5）、絲裂原活化蛋白激酶-14（MAPK14）、 蛋白酪氨酸磷酸酶非受體1 型mRNA（PTP）、凝血酶（THR）、碳酸酐酶II（CA2）。 網絡中有一個化合物與多個靶點相互作用的現象，也有同一個靶點與不同化合物作用的現象， 揭示大黃芩魚散的多成分與多靶點間共同產生作用的機制，與中草藥復方的作用特點相符合。

表2 大黃芩魚散主要作用的8 個關鍵靶點

圖1 “化合物-靶點”的網絡關系圖

3 討論

當病毒、細菌感染導致咽喉、扁桃體等部位的呼吸道黏膜急性炎癥時，Kawasaki & Kawai（2014）、De Nardo（2015）提出病原體可與免疫細胞上Toll 樣受體（TLRs） 結合，隨后通過TLRNF-κB 信號通路產生接續的一系列特定基因表達，最后產生諸如IL-1、IL-6、IL-12 和TNF-α 等炎癥因子，調節機體的炎癥反應。 同時，IL-1、IL-6 和TNF-α 的增多會活化B 淋巴細胞受體介導的免疫通路而產生抗體， 從而進一步激活MPK、PI3K-AKT 和NF-κB 信號途徑，導致一系列炎癥反應，誘發全身性免疫應答。 Dinarello（2004）提出前列腺素E2（PGE2）是中樞性正調節介質之一，很容易彌散透過血腦屏障， 作用于下丘腦溫度敏感神經的PGE2 受體， 通過提高細胞內cAMP 使調定點升高， 并且薛瑞等 （2011）、Ricciotti 和FitzGerald（2011）提出PGs 是重要的致炎、致痛和致熱介質，PGE2 通過其受體和其他前列腺類物質共同以條件依賴方式參與了調節炎癥反應的不同階段。本研究的靶點預測結果提示，大黃芩魚散中的黃酮類成分山奈酚、漢黃芩素、蘆薈大黃素、金合歡素、黃芩新素、千層紙素A、（-）-兒茶素水合物、蘆丁、黃芩苷，甾醇類成分β-谷甾醇、α-波菜甾醇，木質素類成分丹參素，有機酸類成分大黃酸等化合物可通過作用于誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、鈣調蛋白（CAL）、轉錄因子AP-1 （AP-1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Chk1）、絲裂原活化蛋 白 激 酶 （MPK14、MPK8） 等 靶 點， 調 節 如MAPK、TNF、Toll 樣受體、NF-κB、cAMP、Ca2+等信號通路，產生解熱、鎮痛、抗炎作用。 與韓彥琪等（2021）報道的復方魚腥草合劑清熱解毒藥效物質及其作用機制有相似之處。 下一步將利用LPS 誘導巨噬細胞RAW264.7 細胞炎癥模型，研究大黃芩魚散中主要活性成分作用的信號通路， 以進一步確證大黃芩魚散清熱解毒的作用機制。

綜上所述， 本研究通過網絡藥理學手段構建了大黃芩魚散中主要活性成分與可能靶點之間的相互作用， 初步闡釋了其清熱解毒藥效的作用機制及藥效物質基礎， 為后續確證大黃芩魚散的作用機制及質量標志物奠定了理論基礎。