一例產氣莢膜梭菌與大腸桿菌、豬圓環病毒混合感染的診治

邵洋洋，陳勝男，林金森，鐘汝情，鄒育根，謝 瑩，李佳明，陳菲菲，張 杰，郭文娥

（廣州中科基因檢測服務有限公司，廣東 廣州 510000）

產氣莢膜梭菌又稱魏氏梭菌，是一種重要的人畜共患致病菌，可分為 A、B、C、D、E 型，在豬群中主要流行A、C型，A型主要產生α-毒素，產生腸毒血癥，導致中、大豬的突然死亡；C型主要產生α、β-毒素，是造成仔豬紅痢的主要病因。其普遍存在于人畜糞便、土壤、水、塵埃中，加之夏季高溫高濕氣候、雨水多等因素，加快了細菌、病毒繁殖擴散和傳播速度，極易造成產氣莢膜梭菌等一些自然疫源性疫病的流行。產氣莢膜梭菌常與巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌混合感染，使病情更加嚴重。

1 發病情況與剖檢癥狀

2021年8月份，廣西某大型種豬場引進后備種豬后，豬群出現精神沉郁、眼屎淚斑增多、群體腹瀉。隨后陸續出現呼吸急促，腹圍迅速膨大，有腹痛表現，臥地不起，伴有體溫升高等癥狀，并且不斷出現死亡豬只。剖檢可見血性的心包積液，腹腔臟器漿膜纖維蛋白滲出，全身性感染繼發肺部感染，導致肺部高度水腫、器官帶有泡沫性液體，血源性散播導致干泛區域至全肺可見小葉性病變，手觸有細小顆粒感，從細支氣管內可擠出黏性、膿性分泌物，肝臟淤血腫大、肝出血，小腸出血、空腸及回腸嚴重鼓氣，腹股溝淺淋巴結腫大呈黑紫色、切面呈大理石樣，急性出血性淋巴結炎（見圖1）。

圖1 發病豬只病理解剖圖

2 實驗室檢測

2.1 細菌的分離鑒定

2.1.1 觸片鏡檢

取干凈的載玻片，表面用點燃的酒精棉進行擦拭消毒，無菌操作切出一小塊肺臟組織，再用新鮮切面進行觸片，以酒精燈火焰固定，進行革蘭氏染色鏡檢。肺臟觸片經革蘭氏染色可見優勢菌，革蘭氏陽性粗壯桿菌、兩頭鈍圓、菌體大小為（0.9~1.3）×（3.0~9.0）μm、無鞭毛、未見芽孢；革蘭氏染色陰性菌、無芽孢、兩端鈍圓的短桿菌（見圖2）。

圖2 肺臟觸片鏡檢結果（H.E.染色10×）

2.1.2 分離培養

無菌操作用接種環在新鮮的肺臟和肝臟切面蘸取少量組織，在血瓊脂培養基進行過“Z”字形劃線，將上述培養基置于37℃恒溫需氧培養箱中培養24 h。重新切取新鮮組織，在加有1%的NAD血瓊脂培養基進行劃線，37℃厭氧培養箱中培養24 h。

過夜需氧培養的血瓊脂培養基上有大量密集的白色呈中等大小的菌落，鏡檢為革蘭氏陰性桿菌; 厭氧培養箱過夜培養的血瓊脂培養基上長有中等大小有溶血環的菌落，鏡檢為粗短大桿菌，兩端鈍圓，單個或成雙排列，偶見鏈狀的革蘭氏陽性桿菌（見圖3）。

圖3 肺臟觸片鏡檢結果（H.E.染色10×）

2.1.3 16 S rRNA測序及序列分析

挑取單個陰性菌落接種到普通肉湯中，置于培養箱中恒溫振蕩培養增菌；陽性菌落接種到液體硫乙醇酸鹽培養基厭氧培養。取過夜培養的菌液，利用通用引物擴增細菌的16S rRNA。Es Taq MasterMix聚合酶PCR反應體系20 μL， 其中2×Es Taq MasterMix 10 μL，上下游引物各1 μL，細菌模板2 μL，加滅菌超純水4 μL。PCR擴增程序為，94℃預變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸 20 s，30個循環；最后72℃ 延伸5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，均擴增出約1 428 bp的片段與目的條帶大小一致（見圖 4）；PCR產物送廣州擎科生物技術有限公司測序，所得序列進行BLAST比對分析。分別將2株分離菌的16S rRNA 測序結果進行BLAST比對，確定革蘭氏陽性菌測序結果比對為產氣莢膜梭菌型D型，革蘭氏陰性菌測序結果比對為大腸桿菌。

圖4 16S rRNA PCR產物電泳圖

2.2 大腸桿菌和產氣莢膜梭菌藥物敏感試驗

采用瓊脂擴散法（K-B）測定大腸桿菌和產氣莢膜梭菌對豬場常用抗菌類藥物的敏感性。用無菌接種環挑取單個菌落，將確定好的藥敏紙片分貼到平板表面。37℃培養16~24 h以后，測量各藥敏紙片抑菌圈直徑，結果見表1、表2。

表1 大腸桿菌藥物敏感試驗

表2 產氣莢膜梭菌藥物敏感試驗

2.3 常規病毒q-PCR檢測

無菌采集病死豬的肝臟、肺臟、淋巴結，加入5倍體積的PBS，組織研磨儀研磨后離心，取200 μL上清液，使用核酸自動提取儀提取核酸，用世紀元亨商品化試劑盒檢測豬藍耳病病毒、豬圓環病毒2型、豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒。結果表明，病料中除豬圓環病毒2型，其他病原均為陰性。

3 防治措施

全群飼料添加地美硝唑20%2.5 kg/t、復方阿莫西林10% 2~3 kg/t以及恩諾沙星1 kg/t，另外可適當添加保肝顆粒防止用藥時間長對肝損傷嚴重。對于嚴重的個體病例，肌注板藍根注射液0.1~0.2 mL/kg用以中和內毒素、頭孢噻肟注射液、恩諾沙星注射液；后續豬群逐漸穩定，死亡率降低；但仍要做到加強飼養管理，做好預防保健。不同棟舍人員嚴格隔離，專人專崗不能隨意串舍串崗；對發病的豬只做到及時隔離、及早治療，防止疾病的交叉傳播；另外對該豬群的免疫程序進行核查，補打豬圓環病毒疫苗，同時做好豬瘟、豬藍耳病、豬偽狂犬病等常見病毒病疫苗的免疫，提高豬群整體免疫力；加強環境管理，對產房、豬舍、周圍環境做好消毒工作，控制好豬舍溫度、濕度，夏季保持通風、冬季防止賊風侵入。

4 討論

自從2020年7月飼料全面禁抗以來，全國豬場細菌性感染的病例逐漸增加，腸道有害病原菌得不到有效地控制，加之飼料高溫、水源酸化、消毒，以前從飼料和水源中能得到有益菌補充這一途徑被切斷，沒有了有益菌的平衡作用，有害菌過量繁殖以梭菌性疾病、大腸桿菌、沙門氏菌等全身性感染尤為常見，豬群腸道健康問題突出，導致育肥階段特別是保育階段的腹瀉率增加、成活率下降，最終生長變緩、料重比增加，經濟效益直接下降。加之后非洲豬瘟時代行情低迷，常規免疫程序未能完全執行，導致豬群整體免疫力下降，因此在應激或者免疫抑制性疾病（如豬圓環病 毒病等）存在情況下，很容易導致細菌性疾病的全身感染，給臨床獸醫的診斷治療帶來困難。