雙水相超聲法提取野蘑菇三萜類化合物的工藝優化

王浩豪，王術榮 (.晉城市綜合檢驗檢測中心，山西晉城 048000；.山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷 03080)

野蘑菇(Schaeff ex Fr.)，又名田蘑菇，屬擔子菌綱(Basidiomycetes)傘菌目(Agaricales)蘑菇科(Agaricaceae)蘑菇屬()，多分布于黑龍江、內蒙古、新疆、青海、山西、西藏等地。野蘑菇的子實體中到大型，食用起來口感細嫩、味道鮮美，營養價值高。野蘑菇也可藥用，有驅除風寒、舒經活絡的奇效，是清代名藥“舒筋散”中的主要成分。近年來，相關研究發現野蘑菇有抗炎、抗腫瘤、抗衰老、預防三高、保肝護肝及優化血管神經系統等作用。這與其中的三萜類化合物、多糖、多肽、多酚類等生物活性成分密切相關。

三萜類化合物(triterpenoids)大多是由30個碳原子組成的萜類化合物，少量含有27個碳原子。三萜類化合物又叫靈芝酸，廣泛存在于自然界中，有的以游離的形式存在，有的則與糖結合以苷的形式存在，又稱三萜皂苷(triterpenoid saponins)。游離的三萜可溶于有機溶劑，難溶于水。目前已從香菇、樺褐孔菌()、紫芝()、靈 芝()、茯苓()、樺褐孔菌()、粗毛纖孔菌()、紅緣擬層孔菌()等多種真菌中分離出三萜類物質。三萜類化合物具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抑菌等生物活性。目前常用的提取三萜類化合物的方法有回流浸提法、超聲波提取法、超臨界流體萃取法和微波提取法等。回流浸提法根據原料中各種成分在溶劑中的溶解程度不同進行回流提取處理，提取程度劇烈，耗時稍長。超臨界流體萃取得率較高，但成本也高，微波提取則難以規模化應用。超聲波提取技術短時節能，在細胞破碎、藥用成分的分離抽提等方面有廣泛應用。雙水相萃取技術則是通過不同成分在上下兩相溶劑中的選擇性分布來達到分離的目的，該方法可操作性強，可以最大程度地保持提取物質的活性，在細胞、分子生物等研究領域應用廣泛。筆者建立了一種雙水相超聲波提取并用UV法快速檢測野蘑菇菌絲體中三萜類化合物含量的簡便方法，并通過單因素試驗及Box-Behnken試驗設計對提取條件進行了優化，旨在為野蘑菇的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

供試野蘑菇菌種(編號：817)由山西農業大學食品科學與工程學院食用菌實驗室提供。白樺脂醇標準品購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其他試劑未特殊說明均為國產分析純。

提取方法。將4 ℃保藏的野蘑菇菌種于25 ℃活化一段時間后，接種于PDA試管斜面培養基上。在25 ℃下培養10 d直至培養基上長滿菌絲。再將菌種接種并擴大培養在液體培養基中，放入25 ℃恒溫搖床中以120 r/min的速率培養11 d即得到野蘑菇菌絲體。取出菌絲體清洗過濾，置于55 ℃烘箱中干燥。烘干后的菌絲體于微型粉碎機中粉碎成粉末，備用。

取上述菌絲體粉末100 mg，加入5 mL雙水相溶劑浸提2 h，超聲一定時間，離心15 min，取上清液，即為三萜粗提液。

測定方法。

標準曲線的制作 。稱取 2.0 mg白樺脂醇標準品，用少量無水乙醇充分溶解，再加乙醇定容至50 mL，得到質量濃度為40 μg/mL的白樺脂醇標準品母液。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL的白樺脂醇標準品母液于2 mL離心管中，100 ℃沸水加熱蒸干乙醇，依次加入0.2 mL 5%香蘭素-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，充分搖晃，60 ℃金屬浴中保溫20 min后立即放入冰水中降至室溫，隨后再加入乙酸乙酯定容至5 mL，充分搖晃，靜置5～10 min，得到不同濃度的白樺脂醇標準品溶液。

以空白溶液(不加樣品加檢測試劑的空白檢測液)為參比，將白樺脂醇標準品溶液分別在紫外分光光度計中550 nm處測定吸光值。平行試驗3次。以白樺脂醇的質量為橫坐標，吸光值為縱坐標，制作標準曲線。

三萜含量的測定。取三萜粗提液用30%乙醇定容，100 ℃水浴蒸發干粗提液中的有機溶劑，依次加入0.2 mL 5%香蘭素-冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸，充分搖晃均勻，在60 ℃金屬浴中保溫20 min后，放入冰水中降至室溫。再加乙酸乙酯定容至5 mL，充分搖晃，靜置5～10 min后，4 800 r/min 4 ℃離心10 min，以空白溶液作為參比，在550 nm波長處測定溶液吸光度。按照白樺脂醇質量與吸光值關系公式計算三萜含量，并計算三萜提取率：

三萜提取率(%)=××100

式中：為提取液中三萜的質量濃度，mg/mL；為提取液的定容體積，mL；為菌絲體粉末的克數，mg。

單因素試驗。

異丙醇體積濃度的確定。分別稱取100 mg菌絲體粉末樣品于離心管中，加入5 mL異丙醇(體積分數分別為25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%)-硫酸銨(質量濃度為0.225 g/mL)雙水相溶劑中浸泡2 h，超聲(320 W 4 ℃)提取15 min，4 800 r/min離心10 min。取上清液用30%乙醇定容，通過紫外分光光度法測定三萜含量并計算提取率，以確定最佳異丙醇體積濃度。

硫酸銨質量濃度的確定。分別稱取100 mg菌絲體粉末樣品于離心管中，加入5 mL異丙醇(體積分數為40%)-硫酸銨(質量濃度分別為 0.100、0.125、0.150、0.175、0.200、0.225、0.250、0.275、0.300 g/mL)雙水相溶劑中浸泡2 h，超聲(320 W 4 ℃)提取 15 min，4 800 r/min離心10 min。取上清液用30%乙醇定容，測定三萜含量并計算提取率，以確定最佳硫酸銨質量濃度。

超聲時間的確定。分別稱取100 mg菌絲體粉末樣品于離心管中，加入5 mL 40%異丙醇-0.225 g/mL硫酸銨雙水相溶劑中浸泡2 h，分別超聲(320 W 4 ℃)提取 10、15、20、25、30、35、40 min，4 800 r/min離心10 min，取上清液用乙醇定容，測定三萜含量并計算提取率，以確定最佳超聲時間。

提取工藝優化。通過上述單因素試驗，選取異丙醇體積濃度、硫酸銨質量濃度和超聲時間3個因素3個適宜水平設計響應面試驗，利用Minitab軟件程序進行試驗數據分析，從而對三萜提取工藝進行優化。

2 結果與分析

以白樺脂醇的質量為橫坐標，對應的吸光值為縱坐標，制作標準曲線(圖1)。回歸方程為=0008 6-0011 9，式中，為白樺脂醇質量(μg)，為吸光值。該標準曲線線性關系良好，適用于后續試驗野蘑菇菌絲體中三萜含量的測定。

圖1 白樺脂醇吸光值標準曲線Fig.1 Absorbance standard curve of betulin

異丙醇體積濃度的確定。從圖2可以看出，異丙醇體積分數與三萜類化合物提取率的數據關系中存在一個峰值，當異丙醇濃度在40%時，三萜提取率最高，為2.1%。由相似相溶原理可知，雙水相體系中上相40%異丙醇的極性作用與野蘑菇中三萜的極性電性相似，因此三萜提取率較高，可作為進一步優化三萜提取率的體積分數。

圖2 異丙醇體積濃度對野蘑菇三萜提取率的影響Fig.2 Effect of isopropyl alcohol concentration on extraction rate of triterpenoids

硫酸銨濃度的確定。從圖3可知，選擇40%異丙醇作為有機相，硫酸銨質量濃度為0.100～0.225 g/mL時，三萜的提取率隨硫酸銨濃度的升高而增大。當硫酸銨質量濃度為0.225 g/mL時，三萜提取率最高；隨著硫酸銨的質量濃度繼續增大，三萜的提取率又出現一個小的波動，說明上相異丙醇的極性受到非極性鹽硫酸銨濃度的影響，從而改變了三萜類化合物在其中的含量分配。

圖3 硫酸銨質量濃度對野蘑菇三萜提取率的影響Fig.3 Effect of ammonium sulfate concentration on extraction rate of triterpenoids in Agaricus arvensis

超聲波時間的確定。由圖4可知，超聲波時長為10～35 min 時，三萜提取率增大，說明次生代謝產物溶出量隨細胞破碎而緩慢增高。到35 min，提取率達到峰值；超聲時間超過35 min，提取率反而下降，說明超聲過長可能會破壞產物。

圖4 超聲時間對野蘑菇三萜提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of triterpenoids in Agaricus arvensis

Box-Behnken試驗設計。利用單因素試驗結果，根據Box-Behnkenz中心組合試驗設計原理，用Minitab軟件進行試驗設計，響應面法各因素及水平見表1。響應面試驗設計和結果見表2。

回歸模型方差分析結果。以異丙醇體積濃度()、硫酸銨質量濃度()、超聲時間()為響應變量，以三萜提取率()為響應值，對表2數據進行多元回歸分析，得到多元二次回歸方程：=-4810 0+0202 5+10500 0+0073 0-0002 7-25000 0-0002 5+0002 5-0060 0，回歸方程的相關系數為0999 2，擬合狀況良好，表明回歸模型方案可行。由表3可知，模型值小于0.001，說明二次回歸模型顯著，能夠較好地反映值的變化。各因素對值的影響順序是>>>>>>>。超聲時間與超聲時間的二次項()、異丙醇體積濃度與超聲時間的交互項()對三萜提取率的影響達到極顯著水平(<0.01)，異丙醇體積濃度、硫酸銨質量濃度、異丙醇體積濃度二次項、硫酸銨質量濃度二次項對三萜提取率的影響達到顯著水平(<0.05)。各交互因素作用對三萜提取率的影響見圖5。

表1 響應面試驗設計因素水平Table 1 Response surface test design factor level

表2 試驗設計和結果Table 2 Test design and results

表3 回歸方程方差分析Table 3 Regression equation analysis of variance

圖5 各因素交互作用對野蘑菇三萜提取率影響的響應面Fig.5 Response surface analysis of the interaction of various factors on the extraction rate of triterpenoids in Agaricus arvensis

響應面模型條件優化及驗證。利用Minitab軟件對回歸方程求解，得到三萜提取最佳條件：異丙醇體積濃度45%，硫酸銨質量濃度0.175 g/mL，超聲時間35 min，該條件下的提取率為2.94%。為驗證該模型的準確性，取異丙醇體積濃度45%，硫酸銨質量濃度0.175 g/mL，超聲時間35 min(320 W，4 ℃)，在該條件下做3次平行試驗，3次結果的三萜提取率分別為2.83%、2.85%、2.87%，平均提取率為2.84%，與理論預測值的相對誤差為3.52%，說明回歸方程能較真實地反映各選取因素對三萜提取率的影響，證明應用響應曲面法確定的回歸模型可靠。

3 結果與討論

該研究選用超聲輔助異丙醇-硫酸銨雙水相系統萃取野蘑菇中的三萜類物質，異丙醇溶于水，硫酸銨作雙水相的下相，存在穩定且受溫度影響程度小。在使用該方法的提取過程中，三萜在異丙醇-硫酸銨體系中處于異丙醇上相，而除此外的親水性的淀粉、蛋白質、水溶性糖類、果膠等處于鹽水的下相中，既提取了三萜類物質又分離純化了產品的成分。雙水相超聲波萃取與常規超聲提取法相比，減少了提取時長，更好地保留了產物的完整性。該研究在單因素試驗的基礎上，通過Box-Benhnken中心組合試驗設計，建立了二次回歸模型，同時確定雙水相超聲法提取野蘑菇三萜類化合物的最佳工藝條件為異丙醇濃度45%、硫酸銨濃度0.175 g/mL、超聲時間35 min。在該優化條件下，野蘑菇三萜的提取率可達2.84%。經驗證，模型合理，能夠較好地預測雙水相超聲法提取野蘑菇三萜類的提取率，為進一步研究野蘑菇的營養價值和應用價值提供參考。