miRNA-499預測心臟術后新發心房顫動的研究

徐志偉，錢 龍，黃 蘇

淮安市第一人民醫院，南京醫科大學附屬淮安第一醫院心臟外科（淮安 223300）

心臟手術后新發心房顫動(postoperative atrial fibrillation，POAF)的比例較高，尤其是心臟瓣膜手術[1-2]。據報道，POAF 的發生率為20%～50%。POAF 與多種因素有關，包括體重指數[3]、性別、慢性阻塞性肺疾病、瓣膜心臟病[4]、心外膜脂肪組織[5]，以及阻塞性睡眠呼吸暫停[6]等，但確切機制目前仍不清楚。

MicroRNAs(miRNAs)是一類短小非編碼RNA，在細胞增殖、分化、信息和凋亡等生物學過程中發揮著重要作用[7-8]。人類基因組編碼1 000 多個miRNAs，其中30%在心血管系統中可以檢測到[9-10]。多種miRNAs參與調節心房收縮力、離子通道性能和自律性[11-12]。

部分miRNAs 的異常表達可能與POAF 有關，并在其發病過程中起關鍵作用[13-14]。既往研究證實心臟術后POAF病人和正常對照組病人(非POAF)外周血miRNAs表達量的差異[15]。本研究通過外周血miRNA-499的表達差異證實其對POAF 的預測作用，此外，還評價了miRNA-499作為生物標志物監測POAF病人使用胺碘酮進行治療的有效性。

1 對象和方法

1.1 研究對象

本研究由江蘇省淮安市第一人民醫院倫理委員會批準，所有納入本研究的病人均征得知情同意。納入2020年1月至9月接受心臟瓣膜手術的POAF病人109例。通過匹配相關的臨床變量(如年齡、性別)以及臨床特征(如高血壓、體重指數、心肌梗死、吸煙、左心室射血分數和體外循環)，選擇既往96 名非POAF 心臟瓣膜手術病人為正常對照組。POAF 定義為從心臟手術后即刻開始至出院心電監護記錄到房顫持續時間＞30 min。所有病人均通過術前12導聯心電圖或者動態心電圖及病史排除既往房顫病史。其他排除標準包括有嚴重呼吸系統疾病史、神經系統疾病史、凝血障礙史、腎或肝功能不全史、目前除β-受體阻滯劑外的抗心律失常藥物治療、左心室射血分數＜35%或急診手術。

POAF 組用胺碘酮按常規方案治療術后新發POAF。出院前恢復竇性心律納入胺碘酮治療陽性組[胺碘酮（+）]，仍為房顫心律納入胺碘酮治療陰性組[胺碘酮（-）]。胺碘酮按推薦劑量給藥(靜脈負荷量150 mg，然后0.5～2 mg/min靜脈維持，口服后靜脈用藥逐漸減量，口服200 mg，3 次/d，共5 d，然后改為1 次/d至術后1月。

1.2 臨床樣本收集

非POAF 病人于術后24 h 及出院前留取2 次外周靜脈血標本，POAF病人于發生心房顫動30 min后及出院前留取2 次外周靜脈血標本，其中出院前恢復竇性心律納入胺碘酮治療陽性組[胺碘酮（+）]，仍為房顫心律納入胺碘酮治療陰性組[胺碘酮（-）]。上述標本均留取外周靜脈血5 mL，枸櫞酸鈉抗凝，使用miRNeasy Serum/Plasma kit (Qiagen，Redwood City，CA，USA)提取包括miRNA 在內的總RNA。所有步驟均在生物安全柜中進行，并在冰上進行操作，以預防RNA 降解導致提取的RNA 總量降低。參照既往文獻報道方法[8]，通過在每個血清樣本中添加25 fmol 的cel-miRNA-39(Applied Biosystems，CA，USA)試劑進行均一化，以降低RNA 提取過程中樣品變異問題對最終檢測結果的影響。上述具體操作參照說明書進行。

1.3 實時聚合酶鏈反應

RT-PCR進一步檢測miRNA-499的表達水平。參照試劑盒(Bioteke，Beijing，China)說明進行。加入SYBR Green PCR Master Mix (Applied BiStudioystems，USA)，進行PCR 擴增。RT-PCR 反應條件為：95 ℃，10 min 預變性；95 ℃，15 s 變性；60 ℃，1 min 退火延伸，45個循環進行擴增，每個樣品重復3次。

1.4 統計學分析

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。計量資料采用表示，多個樣本均數比較采用單因素方差分析（one way-ANOVA），兩兩比較采用LSD法，兩個樣本均數比較采用t檢驗；為探討miRNA-499 作為預測標志物的潛力，繪制了受試者工作特征(the receiver operating characteristic，ROC)曲線，并通過靈敏度和特異度計算曲線下面積(AUC)。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料對比

POAF組病人109例（男40例，女69例），平均年齡(62.6 ± 7.7)歲；非POAF 組病人96 例（男39 例，女57例），平均年齡（60.3±5.1)歲。對兩組病人的性別、年齡、體重指數、吸煙、高血壓、心肌梗死、左心室射血分數等參數進行比較，均無統計學差異（P＞0.05，見表1)。POAF 組根據出院時心電圖分為胺碘酮（+）組（n=76）和胺碘酮(-)組（n=33）。在推薦劑量下未觀察到胺碘酮的不良反應。

表1 POAF組與非POAF組兩組基本臨床資料分析Table 1 Analysis of basic clinical data of POAF group and non-POAF group

2.2 miRNA-499在兩組病人中的比較

在非POAF 組病人中，術后24 h及出院前miRNA-499 表達量差異無統計學意義（P＞0.05）；在POAF 組病人中，無論AF發生后30 min還是出院前miRNA-499表達量均較非POAF組病人術后24 h有明顯上調，差異有統計學意義（P＜0.05）；而胺碘酮(+)組在出院前較AF發生后30 min的miRNA-499表達量下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；胺碘酮(-)組在AF 發生后30min及出院前miRNA-499 表達量的差異無統計學意義（P＞0.05）。和胺碘酮(-)組相比，出院前胺碘酮(+)組miRNA-499 表達量明顯下調，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

表2 各組病人外周血miRNA-499表達的比較（）Table 2 Comparison of the expression of miRNA-499 in peripheral blood of patients in each group（）

表2 各組病人外周血miRNA-499表達的比較（）Table 2 Comparison of the expression of miRNA-499 in peripheral blood of patients in each group（）

注：a表示出院前非POAE組與胺碘酮（-）組比較

2.3 POAF對胺碘酮治療的反應

POAF組病人中，胺碘酮(+)組miRNA-499表達水平出院前明顯低于胺碘酮(-)組，差異有統計學意義(t=2.636，P=0.009)。此外，ROC 曲線分析顯示，以miRNA-499 的相對表達量作為區分胺碘酮(+)組和胺碘酮(-)組的最佳界值為0.3，其特異度為62%，敏感度為79%(AUC=0.72，P=0.006，見圖1)。

圖1 ROC曲線顯示miRNA-499表達水平預測POAF病人對胺碘酮的治療效果Figure 1 ROC curve showed that the expression level of miRNA-499 predicted the treatment effect of amiodarone in POAF patients

3 討論

microRNA 是一類長度為18～25 個核苷酸的內源性非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，參與調控細胞生長、分化和凋亡等各個環節[16-17]，在生物血漿中高度穩定，是一種簡單、有效的新興生物學標志物[18]。既往研究也證實陣發性房顫和持續性房顫病人表現出不同的miRNA表達譜[19-20]，能夠對心房電重構產生影響，如miRNA-133、miRNA-1 通過對鉀通道基因表達進行調節，可能對心臟電活動傳導及節律產生影響，miRNA-21等參與鈣通道的調節[21-23]。

在本研究中，我們比較了POAF病人與非POAF病人外周血中miRNA-499 的表達，結果表明POAF 組病人中，無論胺碘酮(+)組和胺碘酮(-)組miRNA-499的表達均顯著高于非POAF 組病人。說明外周血miRNA-499表達的上調與心臟瓣膜術后POAF 的發生顯著相關，可能與鉀通道功能喪失有關，進一步研究或許可以通過miRNA-499 的表達預測術后POAF 的發生。

心臟電生理功能惡化，通過喪失部分離子通道功能來促進心房重構，是維持心房顫動的基礎[24-25]，也導致部分持續性心房顫動用胺碘酮治療效果不佳。本研究，評估了胺碘酮治療的反應性，胺碘酮(-)組病人無論AF 發生后30 min 還是出院前miRNA-499 表達量無明顯變化，與胺碘酮(+)組病人相比，胺碘酮(-)組出院前miRNA-499 表達量仍明顯升高。ROC 曲線分析表明，miRNA-499預測胺碘酮治療反應的特異性為62%，敏感性為79% (AUC=0.72)，驗證了miRNA-499 可以預測胺碘酮對心臟瓣膜術后POAF病人的治療效果。

4 結論

miRNA-499表達量增加可能有助于臨床判斷心臟術后POAF的發生，同時還可以預測胺碘酮對心臟瓣膜術后POAF病人的治療效果。

（利益沖突：無）