反式西紅花酸-環糊精包合物的制備、表征、安全性和抗腫瘤評價

劉雪城，丁平剛，金皓潔，何凌云*，劉陶世*

反式西紅花酸-環糊精包合物的制備、表征、安全性和抗腫瘤評價

劉雪城1, 2，丁平剛1，金皓潔2，何凌云2*，劉陶世1*

1. 南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023 2. 南京艾德凱騰生物醫藥有限責任公司，江蘇 南京 211100

制備難溶性藥物反式西紅花酸（-crocetin，TC）與甲基-β-環糊精（methyl-β-cyclodextrin，MβCD）的包合物（TC-MβCD），并評價包合物對TC溶解度、安全性和有效性的影響。采用單因素實驗和Box-Behnken響應面法篩選環糊精種類等工藝參數，采用冷凍干燥法制備TC-MβCD。采用掃描電子顯微鏡（SEM）、UV法、體外釋放度測定法等對TC-MβCD包合物進行表征，采用HPLC法測定TC含量。采用Caco-2細胞模型研究TC與TC-MβCD的體外轉運機制。采用斑馬魚魚卵/胚胎發育保護模型評價TC-MβCD包合物的安全性，采用體外乳腺癌4T1細胞和裸鼠體內乳腺癌MCF-7腫瘤模型對比研究TC及TC-MβCD的體內外抗腫瘤活性。在5種環糊精中，MβCD對TC的增溶效果最好，優化包合工藝參數為料液比33%，攪拌溫度60 ℃，攪拌時間120 min。TC-MβCD凍干粉中TC含量2.2%，增溶效果顯著，復溶性良好。SEM和UV法表明TC被MβCD的空穴結構包合，TC-MβCD凍干粉可在0.1%聚山梨酯80-pH 6.8介質中釋放，其擬合曲線符合一級釋藥模型。Caco-2細胞模型表明TC轉運機制為被動擴散，包合促進吸收。斑馬魚魚卵/胚胎發育試驗發現，TC-MβCD包合物對斑馬魚的孵化率、斑馬魚胚胎的存活率和心率幾乎沒有影響，表明包合物安全性好。乳腺癌4T1細胞體外抗腫瘤表明TC-MβCD的IC50明顯低于TC，說明包合物對乳腺癌細胞有更強的抑制作用。裸鼠體內MCF-7腫瘤模型表明，相同藥物劑量下，TC-MβCD的抑制率為33.71%，遠高于TC的16.86%。采用相溶解度法篩選出合適的環糊精，通過冷凍干燥制備TC-MβCD凍干粉，并對其進行評價。TC被MβCD包合后，顯著增加了TC的溶解度，提高了TC的抗腫瘤活性和安全性，為TC包合物制劑工業化生產提出理論依據。

反式西紅花酸；甲基-β-環糊精；包合物；表征；藥物釋放；抗腫瘤

反式西紅花酸（-crocetin，TC）是西紅花與梔子等中的主要活性成分之一，具有抗癌、改善潰瘍結腸炎、神經保護和保肝護臟等藥理活性[1-3]。但其幾乎不溶于水、乙醇、甲醇、醋酸乙酯，易溶于堿溶液，口服吸收差，易氧化不穩定，極大地限制了其藥理效應的發揮[4-7]。為提高TC的水溶性、穩定性和藥效，國外先后將西紅花酸制成聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA］納米粒、脂質體、微囊和樹枝狀大分子等新型給藥系統，但效果不太理想[8-12]。環糊精是直鏈淀粉在由芽孢桿菌產生的環糊精葡萄糖基轉移酶作用下生成的一系列環狀低聚糖以及其半合成衍生物的總稱。環糊精在食品和藥品行業有著廣泛應用，在藥物制劑中環糊精常作為藥物載體用于提高藥物溶解度、提高藥物穩定性、矯味、緩釋和靶向作用等[13-14]，常用的環糊精主要有α-環糊精、γ-環糊精、β-環糊精及其衍生物。不同環糊精因結構差異使得其包合性能有所不同。采用環糊精包合技術擬提高TC的水溶性、穩定性和藥效是值得探索的方法，本實驗對TC環糊精包合物的制備工藝、質量表征、體外釋藥、吸收機制、安全性和抗腫瘤藥理活性進行較系統的研究，為后續TC與甲基-β-環糊精（methyl-β-cyclodextrin，MβCD）的包合物TC-MβCD的新藥研發打下基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀，SPD檢測器，日本島津儀器公司；XP型分析天平（＝0.01 mg）、S220-K pH計，梅特勒托利多公司；UV-2450PC型紫外/可見分光光度計，日本島津儀器公司；ZNCL- GS型磁力攪拌器，南京文爾儀器設備有限公司；LY0-0.5型真空冷凍干燥機，上海東富龍科技有限公司；FEI PHENO型掃描電子顯微鏡（SEM），日本電子株式會社；Thermo HERA cell 150i CO2細胞培養箱，美國Thermo公司；Millicell-ERS型細胞電阻儀，美國Millipore公司；Transwell培養板，美國Corning公司；BCM-1000A型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；Vision G2 Elite 8型智能溶出儀，美國Hanson公司；MD34透析袋（截留相對分子質量1000），美國Viskase公司；Nikon TS100型倒置顯微鏡，日本尼康公司；Zeiss Axio Vert. A1型熒光顯微鏡，德國Carl Zeiss AG；MK3&4MK2酶標儀，美國Bio Tek公司。

1.2 材料

TC對照品，批號wkq16041207，四川省維克奇生物科技有限公司，HPLC測定質量分數≥99%；TC原料藥，批號190106，濟南浩化實業有限責任公司，質量分數＞98%；甲醇，Honeywell公司，色譜純；α-環糊精、β-環糊精、γ-環糊精、MβCD、羥丙基-β-環糊精，山東濱州智源生物科技有限公司；DMEM培養基，美國Gibco公司；胎牛血清，美國Hyclone公司；小鼠乳腺癌4T1細胞（American type culture collection，ATCC）、人乳腺癌細胞系MCF-7（中國科學院細胞庫）；CCK-8試劑盒（Bioworld公司）；Caco-2細胞株（American type culture collection，ATCC）；EdU細胞增殖檢測試劑盒（R11053.9），廣州銳博生物技術有限公司；水為高純水，其他化學試劑均為分析純。

實驗用斑馬魚，4月齡野生型AB斑馬魚，購買于南京一樹梨花公司。雄性裸鼠，SPF級，體質量（22±2）g，購買于江蘇凱基生物技術股份有限公司，所有動物實驗遵循南京中醫藥大學倫理委員會有關實驗動物管理和使用的規定，均符合3R原則。

2 方法與結果

2.1 TCHPLC測定方法學的建立

2.1.1 色譜條件[15]LC-20A島津高效液相色譜儀，色譜柱Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水-冰醋酸（75.0∶24.5∶0.5），檢測波長423 nm，柱溫35 ℃，體積流量1 mL/min；進樣量20 μL。色譜圖見圖1。

圖1 TC對照品(A)和TC-MβCD包合物(B) 的HPLC圖

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取TC-MβCD凍干粉10 mg，置20 mL量瓶中，加流動相稀釋，超聲破化包合結構，使其充分溶解，冷卻至室溫，加流動相稀釋至刻度，搖勻。

2.1.3 線性范圍考察 精密稱取5.01 mg TC對照品至100 mL量瓶中，加吡啶5.0 mL溶解，流動相稀釋至刻度，即得50.1 μg/mL的對照品儲備液，精密量取儲備液0.1、0.5、1.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mL于50 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度。即得含TC 0.100 2、0.501、1.002、4.008、8.013、12.024、16.032、20.04 μg/mL的系列對照品溶液。以峰面積（）為響應值對TC的質量濃度作圖，繪制標準曲線，得回歸方程為＝12 704 1＋11 760，2＝0.999 8，表明TC在0.100 2～20.04 μg/mL與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.4 精密度試驗 取12.024 μg/mL對照品溶液，連續重復進樣6次，每次20 μL，峰面積的RSD為0.39%，結果表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗 按“2.1.2”項下方法制備包合物供試品溶液，取12.024 μg/mL TC對照品溶液和TC包合物供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10 h進行測定，前者RSD為0.47%，后者RSD為1.44%，結果表明10 h內對照品溶液和供試品溶液穩定。

2.1.6 重復性試驗 按照“2.1.2”項下方法制備包合物供試品溶液6份，包合物中TC的平均質量分數為2.25%，RSD為0.77%，結果表明該方法重復性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗 取9份TC-MβCD包合物，精密稱定，分別按樣品中TC含量添加TC對照品適量（80%、100%、120%各3份），測得TC平均加樣回收率為96.37%，RSD為2.15%，結果表明該方法回收率良好。

2.1.8 樣品測定 取各實驗項下樣品，制備成供試品溶液，按“2.1.1”項色譜條件檢測各個樣品中TC含量。

2.2 相溶解度法研究環糊精對TC的增溶作用

2.2.1 環糊精種類、用量和溫度對TC的增溶試驗 分別精密稱定α-環糊精、β-環糊精、γ-環糊精、MβCD、羥丙基-β-環糊精，用蒸餾水分別配制成濃度分別為2、4、6、8、10 mmol/L的溶液。加入過量TC于上述溶液中，分別在15、37、60 ℃避光條件下置于電熱恒溫震蕩水槽（轉速為200 r/min）振搖48 h，溶解平衡后，微孔濾膜濾過（0.45 μm），測定濾液中TC的含量。表1結果表明，當不添加環糊精時，TC在水中的溶解度很小，僅有0.72 μg/mL，當添加環糊精后，TC在水中的溶解度增大，其增溶效果與環糊精種類、用量和溫度有關。環糊精濃度越大、溫度越高、增溶效果越好。但是只有MβCD對TC的增溶效果顯著，其他4種環糊精增溶效果不理想。

2.2.2 MβCD對TC的包合常數（） 包合物的形成過程是主客體相互選擇性識別的動態平衡過程，而值大小能夠反映出環糊精和藥物形成包合物過程中結合力的強弱[5]。一般值越大說明包合效果越好。通過包合物的相溶解度曲線得出其線性方程，再計算。

＝/[0(1－)]

為相溶解度曲線的斜率，0為TC在各溫度下水中的飽和溶解度

表2結果表明，隨著溫度的升高，MβCD對TC的逐漸增大，說明升高溫度包合效果越好。MβCD在不同溫度下，與TC包合的吉布斯自由能變化（Δ）＜0，表明MβCD與TC的包合自發進行，根據熱力學第2定律，疏水作用在包合中起主要作用。

表1 不同溫度條件下環糊精種類和用量對TC增溶效果的比較(, n = 3)

Table 1 Comparison of cyclodextrin types and amounts on solubilization of TC at different temperatures (, n = 3)

表1 不同溫度條件下環糊精種類和用量對TC增溶效果的比較(, n = 3)

溫度/℃環糊精種類溶解度/(μg?mL?1) 2 mmol?L?14 mmol?L?16 mmol?L?18 mmol?L?110 mmol?L?1 15α-環糊精0.73±0.521.19±0.271.13±0.861.37±0.751.42±0.68 β-環糊精0.65±0.290.83±0.500.89±0.571.05±0.541.27±0.80 γ-環糊精0.46±0.320.48±0.310.53±0.170.69±0.430.81±0.34 MβCD1.42±0.343.34±0.486.32±0.638.25±0.6510.55±0.85 羥丙基-β-環糊精0.79±0.401.15±0.391.73±0.482.48±0.542.53±0.65 37α-環糊精0.95±0.451.21±0.371.32±0.821.40±0.681.60±0.45 β-環糊精0.69±0.291.00±0.370.99±0.701.37±0.431.49±0.85 γ-環糊精0.38±0.110.55±0.260.51±0.150.97±0.150.87±0.26 MβCD1.52±0.293.30±0.496.29±0.609.09±0.6311.27±0.85 羥丙基-β-環糊精0.92±0.311.43±0.402.04±0.452.75±0.482.96±0.59 60α-環糊精1.48±0.681.94±0.482.25±0.762.70±0.712.89±0.37 β-環糊精1.14±0.231.68±0.292.31±0.602.61±0.432.80±0.80 γ-環糊精1.11±0.891.32±0.371.31±0.591.72±0.461.91±0.32 MβCD1.90±0.383.72±0.436.41±0.599.32±0.7112.44±0.87 羥丙基-β-環糊精1.14±0.881.91±0.372.29±0.463.16±0.603.62±0.51

表2 MβCD對TC的K值

2.3 TC-MβCD包合物的制備

將MβCD在一定溫度下配成一定濃度的溶液，稱取一定量的TC置于溶液中，在恒溫磁力攪拌器上攪拌（轉速1000 r/min）一定時間，冷凍干燥，即得TC-MβCD包合物。

2.3.1 單因素實驗考察環糊精用量和攪拌條件對TC-MβCD包合率的影響 以不同MβCD質量分數（0、10%、30%、50%、70%）、不同攪拌時間（30、60、90、120、150 min）、不同攪拌溫度（40、50、60、70、80 ℃）以及不同攪拌速率（200、500、1000、1500 r/min）為考察因素，包合率為評價指標，考察各單因素對TC-MβCD包合率的影響，結果不同MβCD質量分數時TC-MβCD的包合率分別為0、（38.6±3.3）%、（78.4±3.8）%、（85.6±4.3）%、（86.2±3.7）%（＝3），不同攪拌時間時TC-MβCD的包合率分別為（32.6±4.2）%、（57.3±2.3）%、（78.6±3.4）%、（81.7±2.3）%、（74.3±3.6）% （＝3），不同攪拌溫度時TC-MβCD的包合率分別為（56.4±1.2）%、（78.6±2.0）%、（82.2±1.7）%、（82.6±1.9）%、（83.0±1.5）%（＝3），不同攪拌速率時TC-MβCD的包合率分別為（73.6±1.4）%、（76.9±1.9）%、（77.4±1.8）%、（78.6±2.0）%、（78.3±1.6）%（＝3）。結果表明，MβCD用量越大，溫度越高，包合率越高，但溫度大于60 ℃后包合率增加不明顯。包合率隨著攪拌時間延長相應提高，但大于150 min后包合率反而下降。攪拌轉速對包合率的影響不顯著。

2.3.2 采用Box-Behnken響應面法優化包合工藝參數 選取影響包合效果較大的MβCD質量分數（1）、攪拌溫度（2）和攪拌時間（3）3個因素，設置3個水平對15個試驗點[16]。結果見表3。

使用Design-Expert 8.0.6軟件對上表數據進行2次多項式回歸擬合，該實驗的2項式擬合方程為包合率＝?133.125－0.1721＋4.9462＋1.3013＋0.011 812＋2.250×10?313－2.500×10?323－0.012 912－0.043 222－5.018×10?332，該方程表明影響包合率的因素主次順序為攪拌溫度＞攪拌時間＞料液比。

表3 處方工藝的Box-Behnken響應面法實驗設計與結果

圖2和表4結果表明，模型優化后給出的最佳參數為料液比33.74%、攪拌溫度58.41 ℃、攪拌時間127.12 min、包合率為86.614%。結合大生產對工藝參數進行修正，得到TC-MβCD 包合工藝料液比33%，攪拌溫度60 ℃，攪拌時間120 min。

采用以上包合工藝制備3批樣品進行驗證，其包封率分別為86.4%、85.7%、87.0%，結果表明，該工藝重復性良好，根據星點設計實驗所建立的數學模型預測性良好。

2.4 TC-MβCD包合物的表征

利用紫外-可見分光光度計檢測原料藥的吸收峰與包合的吸收峰之間的差異[13,18]。圖3表明，TC包合后其在400～500 nm的吸收峰消失。

加強PPP投資型項目安全管理，預防安全事故發生，這是提升項目建設效益的重要保障。但調查顯示，部分參與單位將工作重心放在如何提高項目質量方面，對安全管理不重視，沒有根據項目安全管理需要，制定健全的安全管理制度。再加上在項目運行中忽視加強安全管理，不注重預防安全事故，最終導致不必要損失發生，降低項目建設效益。

圖2 X1、X2、X3對包合率影響的3D曲面圖和等高線圖

表4 方差分析結果

圖3 TC (A)、TC和MβCD物理混合物(B) 與TC-MβCD包合物(C) 的紫外吸收光譜圖

利用SEM觀察TC原料藥及包合物的形態[17]，圖4結果表明TC呈微小顆粒結晶形狀，MβCD呈原弧片狀形片狀，而包合物不同于主客體的形貌，大小和形狀呈現了不規則的塊狀形貌，以上表明主客體之間形成了包合物，結構性質發生改變。

2.5 TC-MβCD的體外釋放[19-20]

精密稱取一定量的TC原料藥和等藥量的TC- MβCD包合物，用0.1%聚山梨酯-80 pH 6.8的水溶液混懸后放入截留相對分子質量1000的透析袋內，兩端用透析夾夾緊保證不滲漏，分別置于以900 mL 0.1%聚山梨酯-80 pH 6.8的水溶液為介質的溶出杯中，將其置于智能溶出儀中，設置溫度（37.0±0.1）℃，轉速75 r/min，進行體外釋放，取樣點分別為10、15、30、45、60、90 min及2、3、4、6、8、10、12、18 h。每次取樣10 mL，同時補加相同溫度的等量介質溶液。樣品溶液用0.45 μm針筒濾頭過濾后，進樣測定TC的質量濃度，計算累積釋放率。TC原料藥因為在釋放介質中溶解度太低，HPLC難以檢測，未繪制出釋藥曲線。TC-MβCD包合物的藥物釋放曲線結果見圖5。表5結果表明，TC從包合物中的釋放符合一級速率釋藥，具有緩釋效果。

圖4 TC (A)、MβCD (B)、TC-MβCD包合物(C)的SEM圖

圖5 TC-MβCD包合物在0.1%聚山梨酯-80 pH 6.8介質中藥物釋放曲線(, n = 3)

表5 TC-MβCD包合物在介質中藥物釋放擬合方程

2.6 Caco-2細胞模型研究TC與TC-MβCD包合物的體外轉運機制[21-22]

Caco-2細胞培養21 d后，取跨膜電阻大于600 Ω/cm2的Transwell培養板，首先，將細胞單層用預熱（37 ℃）的空白漢克平衡鹽溶液（HBSS）洗滌3次，在Apical側（AP）到Basolatera側（BL）的轉運試驗中，將等濃度的TC溶液與TC-MβCD包合物溶液加0.5 mL到AP面作為供給池，將1.5 mL HBSS（pH 7.4）添加到BL中作為接收池。在BL到AP轉運試驗中，將等濃度的TC溶液或TC- MβCD包合物溶液分別加1.5 mL到BL中，并將0.5 mL HBSS添加到AP中。每個實驗組設置3個平行孔。置37 ℃培養箱中培養，分別在120 min時吸取接收池溶液各200 μL進行HPLC測定。結果見表6。TC的app（AP→BL）值與app（BL→AP）值與相差不大（＞0.05），說明TC跨越腸上皮細胞的可能主要轉運途徑為被動擴散。但TC的app（AP→BL）值與app（BL→AP）值與TC-MβCD包合物有顯著性差異 （＜0.05），說明包合促進了TC的吸收，從TC和TC-MβCD包合物的app（BL→AP）/app（AP→BL）值均小于1.5可以看出TC可能不存在外排轉運機制。TC并非通過胞旁轉運及載體介導的轉運，而是主要通過被動的跨細胞擴散而滲透[2]。

表6 制劑對TC (20 μmol?L?1) 在Caco-2細胞轉運的影響

2.7 TC-MβCD包合物對斑馬魚魚卵/胚胎發育的安全性

選取健康的5 hpf的魚卵均勻的分到24孔板中，每孔20枚魚卵。將用E3溶液配制好的含TC不同質量濃度（10、50、100、150、200 μg/mL）的TC-MβCD包合物溶液分別加入到相應的孔中，每孔加入3 mL溶液，每個濃度設置2個復孔。每孔的魚卵作為1個統計數據。分別于24、48、72、96 hpf觀察胚胎的發育情況，并統計24、48、72、96 hpf的胚胎累積死亡率、畸形率、孵化率以及72、96 hpf的心率、體長等。心率的檢測方式：在Leica DMi8顯微鏡4倍視野下計算斑馬魚幼蟲心臟1 min完成搏動的次數。體長的計算方法：在Leica DMi8顯微鏡4倍視野下測量斑馬魚幼蟲眼睛中心到尾巴末端的直線距離。結果見圖6和表7，結果表明TC-MβCD包合物中TC不同質量濃度（10、50、100、150、200 μg/mL）持續孵育下的斑馬魚卵/幼蟲的存活率均在90.0%及以上。將所得存活率的數據進行統計學分析，發現與對照組相比，不同質量濃度下TC-MβCD包合物孵育后的斑馬魚魚卵/幼蟲的存活率均無顯著性差異。

圖6 在24、48、72、96 hpf時間點的斑馬魚的代表性光學圖像(, n = 3)

表7 TC-MβCD包合物不同質量濃度持續孵育下的斑馬魚卵/幼蟲的存活率(, n = 3)

Table 7 Survival rate of zebra fish eggs/larvae incubated continuously at different concentrations of TC-MβCD inclusion complex (, n = 3)

表7 TC-MβCD包合物不同質量濃度持續孵育下的斑馬魚卵/幼蟲的存活率(, n = 3)

孵育時間/hpf存活率/% 對照10 μg?mL?150 μg?mL?1100 μg?mL?1150 μg?mL?1200 μg?mL?1 2495.66±4.3595.50±5.0895.69±4.1098.07±3.6295.82±4.3594.37±5.31 4896.62±3.8795.98±4.1295.82±3.6298.55±3.8796.30±3.8793.89±4.83 7295.50±3.6494.69±4.5895.98±3.8697.75±5.3195.82±5.0793.73±4.38 9695.98±4.3495.66±4.3596.46±3.4898.55±5.0795.50±4.1293.73±4.83

由表8可知，TC-MβCD包合物不同質量濃度（10、50、100、150、200 μg/mL）持續孵育下的斑馬魚卵/幼蟲的累積孵化率最低值均出現在200 μg/mL的質量濃度下，其72、96 hpf的孵化率平均孵化率為86.70%和85.08%。將所得孵化率的數據進行統計學分析，發現與對照組相比，不同質量濃度下TC-MβCD包合物孵育后的斑馬魚魚卵/幼蟲的孵化率無顯著性差異。

表9結果表明，將所得心率的數據進行統計學分析，發現與對照組相比，不同質量濃度下TC- MβCD包合物孵育后的斑馬魚魚卵/幼蟲的心率無顯著性差異。

表8 TC-MβCD包合物不同質量濃度持續孵育下的斑馬魚卵/幼蟲的孵化率(, n = 3)

Table 8 Hatchability of zebra fish eggs/larvae incubated continuously at different concentrations of TC-MβCD inclusion complex (, n = 3)

表8 TC-MβCD包合物不同質量濃度持續孵育下的斑馬魚卵/幼蟲的孵化率(, n = 3)

孵育時間/hpf孵化率/% 對照10 μg?mL?150 μg?mL?1100 μg?mL?1150 μg?mL?1200 μg?mL?1 7293.98±2.1292.75±1.6393.08±1.6896.30±3.5096.14±4.4586.70±1.87 9694.14±2.0992.59±2.5892.59±1.3994.91±4.4295.99±3.4785.08±0.53

表9 TC-MβCD包合物不同質量濃度持續孵育下的斑馬魚卵/幼蟲的心率(, n = 3)

Table 9 Heart rate of zebra fish eggs/larvae continuously incubated at different concentrations of TC-MβCD inclusion complex (, n = 3)

表9 TC-MβCD包合物不同質量濃度持續孵育下的斑馬魚卵/幼蟲的心率(, n = 3)

組別質量濃度/(μg?mL?1)心率/(次?min?1) 對照?166.54±17.89 TC-MβCD包合物10176.70±14.13 50175.96±9.36 100181.91±14.54 150173.23±11.90 200174.72±23.83

2.8 CCK8法測定TC與TC-MβCD包合物的體外抗腫瘤活性

用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37 ℃、飽和濕度、含5% CO2的培養箱中培養4T1細胞。取對數生長期、生長狀態良好的4T1細胞（乳腺癌細胞），用0.25%胰酶消化后細胞計數。將4T1細胞接種到96孔板中，每孔7000個細胞。經過預實驗確定加入的TC原料藥的濃度為0、50、100、200、300、400、500 μmol/L和TC-MβCD包合物制劑濃度為（以TC計）0、25、50、100、200、300、400 μmol/L，以未處理的細胞為對照。第2天，根據藥物濃度的不同將細胞分成12組，更換含有相應濃度藥物的培養基，繼續培養。每種濃度6個重復進行測試。處理48 h后進行CCK8檢測，即各組細胞在檢測時間點時，每孔加10 μL CCK8溶液，繼續在37 ℃、5% CO2培養箱中培養3 h。選擇450 nm波長，在酶標儀法上測定各孔吸光度（）值，記錄結果。利用GraphPad Prism軟件的Dose-response- inhibition算法計算得出藥物對細胞的半數致死濃度（IC50），結果見圖7。結果表明，TC原料藥隨著濃度增大其乳腺癌細胞存活率下降，且呈明顯的濃度依賴性。在低濃度時（≤200 μmol/L）包合物與原料藥相比細胞存活率相差不大。在高濃度時（≥200 μmol/L）細胞存活率包合物均小于原料藥。經GraphPad Prism軟件計算，原料藥對4T1細胞的IC50＝356.0 μmol/L，包合物制劑對4T1細胞的 IC50＝283.5 μmol/L，說明TC包合物比TC原料藥對乳腺癌細胞有更強的抑制作用。

圖7 TC與TC-MβCD包合物不同濃度下的細胞毒性試驗(, n = 6)

2.9 裸鼠體內MCF-7腫瘤模型研究TC與TC- MβCD包合物的體內抗腫瘤活性

2.9.1 動物分組與模型的建立 實驗前將雄性裸鼠（22±2）g保持在無病原體的條件下，正常進食飲水1周后，將對數生長期的0.1 mL MCF-7細胞懸液（1×107細胞/mL）接種到雄性裸鼠的右腋皮下，建立腫瘤模型。當平均腫瘤模型體積達到60 mm3時，將小鼠隨機分為3組（＝6）：對照組、TC組、TC-MβCD組。

2.9.2 給藥與治療 對照組、TC組和TC-MβCD包合物組分別以0.9%鹽溶液，游離的TC（含50 mg/kg TC的0.5%羥丙基甲基纖維素溶液）和TC-MβCD包合物（相當于50 mg/kg的TC）劑量ig從第1天到第12天，每天1次。腫瘤體積用游標卡尺測量，并在第1、3、5、7、9、11、13天測量小鼠的腫瘤體積。并進行統計學分析。在實驗結束時，對動物實施安樂死并剝離腫瘤，統計分析腫瘤體積，計算腫瘤體積抑制率。然后對腫瘤進行蘇木精和曙紅（HE）染色以評估病理變化。

2.9.3 結果 圖8結果表明，TC和TC-MβCD包合物均對腫瘤表現出治療作用，并在給藥后，伴隨著腫瘤壞死。與TC治療相比，TC-MβCD包合物治療后腫瘤的HE染色顯示細胞間間隙增大，組織壞死增加。治療2周的體積-時間曲線如圖9所示。與對照組相比，兩者相同劑量的TC和TC-MβCD包合物，TC-MβCD包合物的抑制率為33.71%，遠高于TC（16.86%），TC-MβCD包合物增強了TC的抗腫瘤作用（＜0.05）。

圖8 HE染色觀測抗腫瘤活性

與TC組比較：*P＜0.05

3 討論

本研究比較了α-環糊精、β-環糊精、γ-環糊精、MβCD、羥丙基-β-環糊精對TC的增溶效果，發現只有MβCD對TC的增溶效果顯著，其他4種環糊精增溶效果一般。環糊精包合方法有飽和水溶液法、超聲法、研磨法、冷凍干燥法、噴霧干燥法等，考慮到TC-MβCD的易溶于水和熱穩定性，選擇冷凍干燥法制備TC-MβCD；單因素實驗發現MβCD用量越大，包合溫度越高，包合時間越長，TC的包合率越高，但溫度大于60 ℃后包合率增加不明顯，包合時間大于150 min后包合率反而下降，此外發現攪拌轉速對包合率的影響不顯著；采用Box- Behnken響應面法優選出最佳包合條件為料液比33%，攪拌溫度60 ℃，攪拌時間120 min。

本實驗采用SEM和紫外光譜驗證了TC-MβCD包合物的形成，采用Caco-2細胞模型研究了TC與TC-MβCD的體外轉運機制，發現包合物能促進TC的吸收。體外釋放度研究表明，TC包合物顯著提高了TC的溶解度并具有一定的緩釋作用，釋藥模型呈一級釋放模型。環糊精包合物中藥物在消化道的釋藥除了與包合物中藥物的擴散滲漏有關外，還受消化酶和大腸菌群對環糊精的降解和消化道其它成分的置換等因素影響，但目前的釋放介質難以復制這些因素，后續將進一步開展TC-MβCD的結構和藥動學系統性研究以闡明環糊精包合對TC生物利用度的影響。

裸鼠體內MCF-7腫瘤模型試驗發現，與TC原料藥相比，TC包合物的體內抗腫瘤藥理活性明顯增強，這可能是由于環糊精包合物的增溶和緩釋作用，提高了TC的生物利用度所致。由于CCK-8檢測非常方便快捷，且CCK-8對細胞的毒性很小，檢測靈敏度高且重復性好，故體外抗腫瘤選用CCK8檢測。體外乳腺癌4T1細胞模型試驗表明TC包合物比TC原料藥對乳腺癌細胞有更強的抑制作用。采用斑馬魚魚卵/胚胎發育試驗發現，TC-MβCD包合物對斑馬魚的孵化率、斑馬魚胚胎的存活和心率幾乎沒有影響，表明包合物安全性好。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation, characterization, safety and antitumor evaluation of-crocetin cyclodextrin inclusion complex

LIU Xue-cheng1, 2, DING Ping-gang1, JIN Hao-jie2, HE Ling-yun2, LIU Tao-shi1

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Nanjing CoreTech Biomedical Co., Ltd., Nanjing 211100, China

To prepare insoluble drugs-crocetin (TC) and methyl-β-cyclodextrin (MβCD) inclusion complex (TC-MβCD), and evaluate the effect of inclusion complex on the solubility, safety and effectiveness of TC.The kinds of cyclodextrins and other process parameters were selected by single factor test and Box-Behnken response surface method, and TC-MβCD was prepared by freeze-drying method. The inclusion complex of TC-MβCD was characterized by scanning electron microscope, UV method andrelease assay, and the content of TC was determined by HPLC. Caco-2 cell model was used to study the transport mechanism of TC and TC-MβCD. The safety of TC-MβCD inclusion complex was evaluated by using zebrafish egg/embryo development protection model. The anti-tumor activity of TC and TC-MβCDandwas compared by using 4T1 breast cancer cell anti-tumor modeland MCF-7 tumor model in nude mice.Among the five cyclodextrins, MβCD had the best solubilization effect on TC. The optimized inclusion process parameters were as follows: solid-liquid ratio 33%, stirring temperature 60 ℃, stirring time 120 min. The content of TC in TC-MβCD lyophilized powder was 2.2%, which had remarkable solubilization effect and good resolubility. Scanning electron microscopy and UV method showed that TC was encapsulated by the hole structure of MβCD, and TC-MβCD lyophilized powder could be released in the range of 0.1% Tween80-pH 6.8, The fitting curve accorded with the first-order drug release model. Caco-2 cell model showed that the transport mechanism of TC was passive diffusion, and inclusion promoted absorption. Zebrafish egg/embryo development test found that TC-MβCD inclusion complex had little effect on zebrafish hatching rate, zebrafish embryo survival rate and heart rate, indicating that the inclusion complex was safe. The anti-tumor activity of 4T1 cellsshowed that the IC50of TC-MβCD was significantly lower than that of TC, indicating that the inclusion compound had a stronger inhibitory effect on breast cancer cells. The MCF-7 tumor model in nude mice showed that under the same drug dose, the inhibition rate of TC MβCD was 33.71%, much higher than 16.86% of TC.Appropriate cyclodextrins were screened out by phase solubility method, and TC-MβCD lyophilized powder was prepared by freeze-drying and evaluated. The inclusion of TC by MβCD significantly increases the solubility of TC, improves the antitumor activity and safety of TC, and provides a theoretical basis for the industrial production of TC inclusion complex preparations.

-crocetin; methyl-β-cyclodextrin; inclusion complex; characterization; drug release; antitumor

R283.6

A

0253 - 2670(2022)15 - 4663 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.009

2022-01-19

國家自然科學基金青年基金項目（81403114）

劉雪城，碩士研究生，從事中藥制藥技術與開發研究。Tel: 15738510895 E-mail: liuxuecheng0924@126.com

通信作者：何凌云，博士，碩士生導師，從事中藥制藥技術與開發研究。Tel: 13057657678 E-mail: helina@core-tech.com.cn

劉陶世，博士，碩士生導師，副研究員，從事中藥藥劑學研究。Tel: 13611504994 E-mail: tsliur4111@sina.com

[責任編輯 鄭禮勝]