植物乳桿菌生物轉化南瓜多糖工藝優化

李小杰 郭 怡 馬 倩 王 璞 肖 萍,2

(1. 天津農學院食品科學與生物工程學院，天津 300392；2. 天津市農副產品深加工技術工程中心，天津 300392)

南瓜又稱番瓜、樓瓜、金冬瓜，為葫蘆科蔓生藤本植物南瓜果實，原產亞洲南部、非洲和南美洲地區[1]。南瓜中富含氨基酸、蛋白質、纖維素及維生素等多種營養成分[2-5]。其中多糖類物質是具有保健功能的生物活性成分。研究表明，南瓜多糖具有抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、降血壓、血糖及血脂作用[8-9]。目前，有關南瓜多糖的研究主要集中在南瓜多糖的分離提取、生物活性及結構研究等方面，對其生物轉化的研究尚未見報道。

生物轉化[10]是利用植物離體細胞或器官、動物細胞、微生物及其細胞器，以及游離酶對外源性化合物進行結構修飾而獲得有價值產物的生理生化反應，其中應用最廣泛的生物轉化技術是利用微生物體系進行化合物的結構修飾[11]。乳酸菌是一類細菌的統稱，這些細菌能夠利用碳水化合物生成乳酸[12-13]。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是乳酸菌的一種，主要用于食品、乳制品、肉類和蔬菜的發酵。Gao等[14]利用從傳統泡菜中分離的植物乳桿菌NCU116對苦瓜多糖進行生物轉化，明顯改善了T2DM模型大鼠高血糖、高胰島素、高血脂和氧化應激水平，并且提高了腸道菌群中Lactococcuslaudensis和Prevotellaloescheii的豐度，降低了腸道pH值。張志紅[15]通過植物乳桿菌NCU116發酵蘆筍漿，探討了發酵蘆筍多糖和蘆薈多糖的理化性質和體內體外活性變化，發現發酵蘆筍多糖的抗氧化能力得到了增強，并提高了其免疫活性，小鼠藥物性肝損傷得到了一定修復。Lee等[16]研究發現，植物乳桿菌生物轉化后的鐵釘菜多糖在體外具有更強的DPPH自由基和羥自由基清除能力，在體內也可減少由伽瑪射線輻照引起的氧化應激斑馬魚的卵黃囊水腫和尾巴彎曲畸形，提高斑馬魚的存活率。彭興興等[17]將乳酸菌應用到南瓜中制成南瓜乳酸發酵飲料，并取得了一定研究成果，但大部分研究主要集中于工藝優化方面[18]，或者是對乳酸菌發酵南瓜風味物質的研究，而對乳酸菌生物轉化南瓜多糖提高其生物活性方面的研究尚未見報道。

研究擬通過植物乳桿菌生物轉化南瓜多糖，并對其工藝條件進行優化，旨在為促進南瓜資源合理深加工，提高其利用效能提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南瓜：市售；

植物乳酸桿菌nbkBC299：諾佰克(武漢)生物科技有限公司；

MRS肉湯培養基：北京索萊寶科技有限公司；

其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機：LGR20-W型，北京京立離心機有限公司；

旋轉蒸發儀：DLK-5003型，寧波新芝生物科技有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：BXM-30R型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；

電子天平：AX224ZH型，奧豪斯儀器(常州)有限公司；

潔凈工作臺：SW-CJ-2FD型，蘇州安泰空氣技術有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-1200型，上海滬粵明科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 植物乳桿菌生物轉化南瓜多糖工藝流程

成熟南瓜→去皮去瓤→打漿→冷凍干燥→南瓜粉→溶解→滅菌(115 ℃、20 min)→冷卻→接種→發酵→冷凍干燥→發酵南瓜粉→溶解→多糖提取→濃縮→醇沉→離心→冷凍干燥→南瓜多糖凍干粉

1.3.2 多糖提取率測定 根據池源等[19]的方法，并按式(1) 計算多糖提取率。

(1)

式中：

R1——多糖提取率，%；

c——多糖的質量濃度，g/L;

v——多糖液體體積，mL;

n——稀釋倍數；

m——樣品質量，g。

1.3.3 DPPH自由基(DPPH·)清除率測定 參照韋獻雅等[20]的方法，并按式(2)計算DPPH·清除率。

(2)

式中：

R2——自由基清除率，%；

Ai——樣品測定管的吸光度；

Aj——空白對照組的吸光度；

A0——樣品對照組的吸光度。

1.3.4 羥基自由基(OH·)清除率測定 參照程龍[21]的方法，并按式(2)計算OH·清除率。

(3)

式中：

Ai——樣品測定管的吸光度值;

A0——樣品溶劑(蒸餾水)代替樣品測定的吸光度。

1.3.6 鐵離子還原力測定 參照雷兵[22]的方法。

1.3.7 植物乳桿菌生物轉化南瓜多糖單因素試驗

(1) 搖床轉速：固定料液比1∶20 (g/mL)，接種量1%，溫度37 ℃，考察搖床轉速(50，100，150，200 r/min)對多糖提取率和DPPH·清除率的影響。

(2) 溫度：固定料液比1∶20 (g/mL)，接種量1%，轉速50 r/min，考察溫度(28，32，37，42 ℃)對多糖提取率和DPPH·清除率的影響。

(3) 料液比：固定接種量1%，搖床轉速50 r/min，溫度37 ℃，考察料液比[m南瓜粉∶V蒸餾水分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40 (g/mL)]對多糖提取率和DPPH·清除率的影響。

(4) 接種量：固定料液比1∶20 (g/mL)，搖床轉速50 r/min，溫度37 ℃，考察接種量(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%)對多糖提取率和DPPH·清除率的影響。

1.3.8 植物乳桿菌生物轉化南瓜多糖正交試驗 在單因素試驗基礎上選擇搖床轉速、溫度、料液比、接種量4個因素，利用L9(34)正交表設計試驗，進一步優化植物乳桿菌生物轉化南瓜多糖工藝。

1.4 數據處理

利用Excel軟件對數據進行處理和統計，結果以“x±S”表示。利用SPSS 22.0軟件對數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌生物轉化南瓜多糖菌種篩選

由圖1可知，生物轉化南瓜多糖對DPPH·的清除率效果最佳的3組為植物乳桿菌nbkBC299搖床發酵48 h>植物乳桿菌nbkBC299靜止發酵48 h>未發酵南瓜靜止24 h，說明通過植物乳桿菌的生物轉化作用可以提高南瓜多糖的體外抗氧化活性。

1. 植物乳桿菌nbkMA2靜止發酵24 h 2. 植物乳桿菌nbkBC299靜止發酵24 h 3.未發酵南瓜靜止24 h 4. 植物乳桿菌nbkMA2靜止發酵48 h 5. 植物乳桿菌nbkBC299靜止發酵48 h 6. 未發酵南瓜靜止48 h 7. 植物乳桿菌nbkMA2搖床發酵24 h 8. 植物乳桿菌nbkBC299搖床發酵24 h 9. 未發酵南瓜搖床24 h 10. 植物乳桿菌nbkMA2搖床發酵48 h 11. 植物乳桿菌nbkBC299搖床發酵48 h 12. 未發酵南瓜搖床48 h 字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 植物乳桿菌nbkMA2和nbkBC299轉化南瓜多糖對DPPH·清除率的影響Figure 1 Effects of pumpkin polysaccharides transformed by Lactobacillus plantae nbkMA2 and nbkBC299 on DPPH free radical scavenging rate

2.2 植物乳桿菌生物轉化南瓜多糖單因素試驗

2.2.1 搖床轉速對植物乳桿菌生物轉化南瓜多糖的影響

由圖2可知，生物轉化南瓜多糖提取率隨搖床轉速的升高逐漸降低，當搖床轉速為50 r/min時南瓜多糖提取率最高為(55.19±0.32)%，顯著高于搖床轉速為100～200 r/min時的(P<0.05)，主要是由于搖床的機械撞擊作用導致南瓜細胞越來越容易被破壞，多糖暴露于細胞外，使菌種更好利用多糖，從而分解多糖，故提取率下降[23]。隨著搖床轉速的提高，南瓜多糖對DPPH·的清除率呈先上升后下降趨勢，當搖床轉速為100 r/min時，南瓜多糖對DPPH·清除率最高為(44.40±0.22)%，且顯著高于其他條件下的(P<0.05)，由于轉速過快，多糖暴露于細胞外而被過多分解成單分子糖類物質，可能造成其對DPPH·清除率的下降。綜上，選取搖床轉速50，100，150 r/min進行正交試驗。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 搖床轉速對南瓜多糖提取率和 DPPH·清除率的影響Figure 2 Effects of shaking speed on extraction rate and DPPH·scavenging rate of pumpkin polysaccharide

2.2.2 溫度對植物乳桿菌生物轉化南瓜多糖的影響 由圖3可知，不同溫度下的生物轉化南瓜多糖提取率無顯著差異。當溫度為37 ℃時，生物轉化南瓜多糖對DPPH·清除率最高為(40.37±0.17)%，且顯著高于其他條件下的(P<0.05)，可能是因為27～37 ℃溫度較低，對多糖結構未產生明顯影響，多糖類物質[24-25]未被破壞，導致其對DPPH·清除率逐漸升高，隨著溫度的升高，多糖結構發生一定的改變而導致活性下降，DPPH·清除率也隨之下降。綜上，選取溫度32，37，42 ℃進行正交試驗。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 溫度對南瓜多糖提取率和DPPH·清除率的影響Figure 3 Effects of temperature on extraction rate and DPPH·scavenging rate of pumpkin polysaccharide

2.2.3 料液比對植物乳桿菌生物轉化南瓜多糖的影響

由圖4可知，生物轉化南瓜多糖提取率隨料液比的增大逐漸降低，當料液比為1∶10 (g/mL)時南瓜多糖提取率最高，與料液比為1∶20～1∶40 (g/mL)時有顯著差異(P<0.05)，可能是由于南瓜細胞或組織內外濃度差隨料液比的增加而減小，不利于南瓜多糖向溶液中擴散，因此南瓜多糖提取率逐漸降低[26]，而當料液比為1∶20 (g/mL) 時生物轉化南瓜多糖對DPPH·清除率顯著高于其他料液比的(P<0.05)。綜上，選取料液比為1∶10，1∶20，1∶30 (g/mL)進行正交試驗。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 料液比對南瓜多糖提取率和DPPH·清除率的 影響Figure 4 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate and DPPH·scavenging rate of pumpkin polysaccharide

2.2.4 接種量對植物乳桿菌生物轉化南瓜多糖的影響

由圖5可知，生物轉化南瓜多糖提取率隨植物乳桿菌接種量的增大逐漸降低，當接種量為0.5%時南瓜多糖提取率最高，與接種量為1.0%時相比無顯著性差異，但與接種量為1.5%～2.0%時相比差異顯著(P<0.05)。可能是因為乳酸菌可以產生如β-半乳糖苷酶、α-糖苷酶、α-葡糖苷酶以及α-甘露糖苷酶等相關的碳水化合物活性酶，降解南瓜多糖。當接種量為1.5%時，生物轉化南瓜多糖對DPPH·的清除率最高為(40.78±0.20)%，顯著高于接種量為0.5%～1.0%時的(P<0.05)，可能是較大的接種量對南瓜多糖分解過度產生了更多的小分子糖類物質，從而造成DPPH·清除率下降。綜上，選取接種量為1.0%，1.5%，2.0%進行正交試驗。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 接種量對南瓜多糖提取率和DPPH·清除率的影響Figure 5 Effects of inoculation amount on extraction rate of pumpkin polysaccharide and DPPH·clearance rate

2.3 植物乳桿菌生物轉化南瓜多糖正交試驗

根據單因素試驗結果，選用L9(34)正交表，以DPPH·清除率為考察指標，對植物乳桿菌生物轉化南瓜多糖工藝條件進行優化。各因素水平見表1，正交試驗設計及結果見表2。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Table of orthogonal test factors

由表2可知，各因素對DPPH·清除率的影響主要次序為搖床轉速>料液比>溫度>接種量，微生物轉化南瓜多糖最優工藝組合為A2B3C3D2，即搖床轉速100 r/min，溫度42 ℃，料液比1∶30 (g/mL)，接種量1.5%，此條件下的生物轉化南瓜多糖對DPPH·的清除率為(47.95±0.19)%；表2中試驗5的DPPH·清除率最高，其生物轉化條件為搖床轉速100 r/min，溫度37 ℃，料液比1∶30 (g/mL)，接種量1.0%，此時DPPH·清除率為(54.61±1.58)%；因此植物乳桿菌生物轉化南瓜多糖最佳工藝條件為搖床轉速100 r/min，溫度37 ℃，料液比1∶30 (g/mL)，接種量1.0%。

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal test results

2.4 南瓜多糖與生物轉化南瓜多糖的體外抗氧化性

表3 南瓜多糖與生物轉化南瓜多糖體外抗氧化性對比?Table 3 Antioxidant activity of pumpkin polysaccharide and biotransformed pumpkin polysaccharide

3 結論