微波輔助萃取藍莓花色苷工藝優化及熱動力學分析

翟賽亞 姚會敏

(河南質量工程職業學院食品與化工學院，河南 平頂山 467000)

藍莓(Vacciniumspp.)富含花色苷[1]。大量研究表明花色苷可顯著清除過量自由基，具有較好抗氧化活性[2]，同時可抑制相關炎癥發生[3]和腫瘤細胞的生長[4]。目前，主要利用回流提取法提取植物基的花色苷，但該方法萃取效率低，溶劑消耗較大，耗時長。為提高花色苷萃取率，并克服傳統萃取的缺點，一些具有發展潛力的萃取技術被用于花色苷的提取中，如微波輔助提取(Microwave-assisted extraction，MAE)、超聲波輔助萃取、超臨界萃取和超高壓輔助萃取等技術，其中MAE具有萃取得率高、節能環保、溶劑消耗少和過程易控制等優點[5]，該技術被成功應用到黃酮類[6]、油脂類[7]、多酚類[8]等活性成分的提取中。

研究將在單因素試驗基礎上，通過響應面耦合遺傳算法優化MAE藍莓花色苷的工藝參數。在此基礎上，利用Fick第一定律建立花色苷的傳質動力學模型，依據Arrhenius方程和相變平衡原理，獲得萃取過程中的活化能(Ea)、熵變(ΔS)、焓變(ΔH)和吉布斯自由能變(ΔG)，分析MAE過程的熱力學，以期為藍莓花色苷進一步深加工提供重要的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美登藍莓：2020年采摘于東北小興安嶺地區，冷藏備用；

矢車菊-3-O-葡萄糖苷(C3G)：純度≥98.5%，寶雞市國康生物科技有限公司；

濃鹽酸、甲醇、無水乙醇：分析純，濟南涵百化工有限公司。

1.2 儀器與設備

分析天平：BSA224S-CW型，上海雙旭電子有限公司；

高級微波萃取系統：Milestone Ethos-8型，意大利milestone公司；

離心機：GL21M型，湖南凱達科學儀器有限公司；

精密數顯恒溫水浴鍋：J-HH-4A型，冠森生物科技(上海)有限公司；

紫外—可見分光光度計：尤尼柯UV-3802S型，上海四藍儀器設備公司；

凍干機：LGJ-10FD型，北京松源華興科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍莓前處理 首先將新鮮藍莓進行挑選、除雜和清洗后，打漿，置于-20 ℃下預凍12 h后，冷凍干燥(至干基含水率低于5%)并粉碎，過40目篩，封裝，于4 ℃下避光保存備用。

1.3.2 萃取 以2.00 g藍莓果粉為原料，按m藍莓果粉∶V乙醇為1∶30 (g/mL)添加體積分數為60%的乙醇并混勻，置于微波工作站進行提取，待萃取結束后進行離心(5 000 r/min，15 min)，取上清液，所得殘渣重復上述操作3次，合并提取液，用于花色苷得率測定。

1.3.3 花色苷萃取率的測定 參考Shen等[9]的方法。

(1)

(2)

式中：

C——花色苷質量濃度，mg/mL；

ΔApH 1.0——pH 1.0時提取液在510 nm和700 nm處的吸光度差值；

ΔApH 4.5——pH 4.5時提取液在510 nm和700 nm處的吸光度差值；

f——稀釋倍數；

y——花色苷提取率，%；

Mω——矢車菊-3-O-葡萄糖苷的相對分子質量，g/mol；

ε——矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾吸光系數，L/(cm·mol)；

L——光程，cm；

V——提取液體積，mL；

m——藍莓粉末質量，g。

1.3.4 單因素試驗

(1) 萃取溫度對藍莓花色苷提取率的影響：固定萃取時間為6 min、乙醇體積分數為60%、料液比為1∶30 (g/mL)，萃取溫度分別設置為30，40，50，60，70 ℃。

(2) 萃取時間對藍莓花色苷提取率的影響：固定萃取溫度為50 ℃、乙醇體積分數為60%、料液比為1∶30 (g/mL)，萃取時間分別設置為2，4，6，8，10 min。

(3) 乙醇體積分數對藍莓花色苷提取率的影響：固定萃取溫度為50 ℃、萃取時間為6 min、料液比為1∶30 (g/mL)，乙醇體積分數分別設置為40%，50%，60%，70%，80%。

(4) 料液比對藍莓花色苷提取率的影響：固定萃取溫度為50 ℃、萃取時間為6 min、乙醇體積分數為60%，料液比(m藍莓果粉∶V乙醇)分別設置為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 (g/mL)。

1.3.5 響應面試驗 在單因素試驗基礎上，選擇的自變量分別為萃取溫度、萃取時間、乙醇體積分數和料液比，響應值為花色苷萃取率(Y)。基于RSM中的Box-Behnken進行設計。

1.3.6 遺傳算法設計 選取萃取溫度(X1)、萃取時間(X2)、乙醇體積分數(X3)和料液比(X4)4個因素為決策變量，即：

X=X(X1，X2，X3，X4)。

(3)

(4)

(5)

遺傳算法優化花色苷提取工藝的約束條件如式(6)所示。

(6)

1.4 花色苷萃取動力學

在MAE藍莓花色苷的過程中，花色苷在藍莓顆粒內溶解，然后由藍莓顆粒內擴散到顆粒表面，進而擴散到主體溶液中的過程[10]。在MAE過程中花色苷濃度變化如圖1所示。

圖1 萃取過程中花色苷濃度變化Figure 1 Changes of anthocyanins concentration in the extraction process

根據Fick第一定律，在任意t時刻通過固液界面的傳質通量J為：

(7)

(8)

式(8)表明花色苷的擴散速率與傳質表面積和質量濃度梯度呈正比。

某時刻質量濃度梯度隨時間的遞減速率與該時刻濃度梯度呈正比[11]。

(9)

式中：

k——花色苷的提取速率常數。

對式(9)進行積分可得：

(10)

將式(8)和式(10)聯立可得：

(11)

(12)

依據R2和標準估計誤差(Standard Error of Estimate，SEE)作為評價提取動力模型，其表達式分別如式(13)和式(14)所示。

(13)

(14)

式中：

ESE——標準估計誤差；

YAC——花色苷含量的試驗值，mg/mL；

1.5 花色苷的提取熱力學

花色苷微波萃取過程中符合相變平衡，其表達式如式(15)所示。

(15)

根據式(15)計算出組分的分配系數K，隨后將K數據代入van’t Hoff方程中，可以計算出MAE過程中ΔH和ΔS。

(16)

利用式(17)可計算MAE過程中的ΔG。

ΔG=ΔH-TΔS。

(17)

1.6 數據處理

利用SPSS 12.0對單因素試驗結果進行方差分析；利用Matlab R2018b軟件優化提取工藝以及對動力學模型進行求解；利用Design Expert 8.0軟件設計MAE藍莓花色苷的組合試驗；利用Origin 9.0Pro對單因素試驗進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 微波萃取條件對藍莓中花色苷萃取率的影響

由圖2(a)可知，當萃取溫度在50 ℃以下時，花色苷萃取率隨萃取溫度的增加而顯著增加，在50 ℃時，花色苷萃取率達到最大值(80.52±1.75)%。其原因是萃取溫度增加有助于更多的花色苷被溶出，同時擴散系數增加，使得花色苷在萃取液中溶解度最大[12]。當萃取溫度繼續上升時，花色苷萃取率卻顯著降低(P<0.05)，可能與花色苷屬于熱敏性成分，高溫破壞了其結構有關[13]。綜合考慮萃取溫度選擇40，50，60 ℃ 3個水平進行組合試驗(見表1)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 單因素對花色苷萃取率的影響Figure 2 Effects of single factor on extraction rate of anthocyanins

由圖2(b)可知，當萃取時間小于6 min時，花色苷萃取率隨萃取時間延長而增加，在6 min時，花色苷萃取率達到最大值(80.11±1.64)%。但當萃取時間超過6 min時，萃取時間越長，越不利于花色苷的提取。這可能是由于花色苷不穩定，易被空氣中的氧氣氧化造成其結構的破壞，導致花色苷萃取率降低[14]。綜上萃取時間選擇4，6，8 min 3個水平進行組合試驗(見表1)。

表1 單因素試驗結果Table 1 Single factor experimental results

由圖2(c)可知，當乙醇體積分數為40%～60%時，隨乙醇體積分數增加花色苷萃取率顯著增加(P<0.05)；當乙醇體積分數超過60%時，花色苷萃取率隨乙醇體積分數增加而顯著降低(P<0.05)。其原因可能是隨乙醇體積分數增加花色苷在萃取液中溶解度和擴散系數增加，有助于花色苷的提取[15]。但高濃度的乙醇會加快雜質的溶解，導致花色苷的溶解度降低，從而使得花色苷萃取率降低[16]。因此，乙醇體積分數選擇40%，50%，60% 3個水平進行組合試驗(見表1)。

由圖2(d)可知，當料液比在1∶30～1∶40 (g/mL)范圍內，花色苷萃取率隨料液比增加呈先顯著增加后顯著降低(P<0.05)。在1∶30 (g/mL)時，花色苷萃取率取得最大值。因此選擇料液比在1∶20，1∶30，1∶40 (g/mL) 3個水平進行組合試驗(見表1)。

2.2 響應面試驗

2.2.1 RSM模型構建和顯著性檢驗 試驗方案和結果見表2。以花色苷萃取率Y為響應值，剔除不顯著的因素，對試驗結果進行多元回歸擬合，所得方程如式(18)所示。

表2 響應曲面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of RSM

(18)

表3 回歸模型系數的方差分析?Table 3 Variance analysis of regression model coefficients

2.2.2 兩因素的交互作用對花色苷萃取率的影響 綜合圖3各因素對花色苷萃取率的交互作用影響得知，當萃取溫度在45～55 ℃、萃取時間5～7 min、乙醇體積分數45%～55%、料液比在1∶25～1∶35 (g/mL)條件下，藍莓花色苷萃取率較高。

圖3 試驗因素的交互作用對花色苷萃取率的影響Figure 3 Effects of interaction of test factors on the yield of anthocyanins

2.2.3 MAE藍莓花色苷的工藝參數優化 利用Matlab R2018b軟件中的遺傳算法工具箱優化花色苷的提取工藝，其結果如圖4所示。由圖4可知，當迭代93次，花色苷萃取率達到最大值，此時萃取溫度、萃取時間、乙醇體積分數和料液比水平編碼分別為1，1，0.702，0.16，即試驗水平分別為60 ℃、8 min、57.02%和1∶31.6 (g/mL)，花色苷萃取率的理論值為84.40%。

圖4 遺傳算法的優化結果Figure 4 The results optimized by the genetic algorithm

2.2.4 驗證實驗 為驗證遺傳算法的可靠性，結合實際情況，將工藝參數修正為：萃取溫度60 ℃、萃取時間8 min、乙醇體積分數57%和料液比1∶32 (g/mL)，在上述參數下進行3次重復實驗，所得花色苷萃取率試驗值(83.15±2.03)%，試驗值和理論值的相對誤差為1.48%。

說明采用遺傳算法優化MAE藍莓花色苷工藝參數是可行的。

2.3 動力學模型的求解

依據不同萃取溫度下花色苷萃取動力學結果，將ln[C∞/(C∞-C)]對萃取時間t進行作圖，其結果如圖5所示。由圖5可知，隨萃取時間延長，ln[C∞/(C∞-C)]的值顯著增加，且在相同萃取時間內，萃取溫度越高，ln[C∞/(C∞-C)]的值越大。

對圖5的試驗數據進行回歸，分別得到提取速率常數(k)、常數(c)，通過R2和SEE大小來判斷模型的精度，不同萃取溫度下，回歸結果如表4所示。由表4可知，隨著萃取溫度的增加，c和提取速率常數k均增加。ln[C∞/(C∞-C)]與t之間的R2>0.99，SEE<4.20。結果表明所建立的花色苷萃取動力學模型能夠準確預測不同提取溫度下花色苷萃取效果。

圖5 不同萃取溫度與萃取時間的動力學擬合結果Figure 5 Kinetic fitting results of different extraction temperature and extraction time

在MAE過程中，提取速率常數k與萃取溫度符合Arrhenius方程，如式(19)所示[17]。

(19)

將式(19)兩邊同時取對數，可得式(20)。

(20)

將表4中的k值，代入式(20)中，然后通過lnk對1/T進行線性擬合作圖，如圖6所示，由于直線的斜率為Ea/R，

表4 不同萃取溫度下ln[C∞/(C∞-C)]與萃取時間t的回歸結果Table 4 Regression equations between ln[C∞/(C∞-C)] and t at different temperatures

截距為lnA0，因此通過擬合方程計算出Ea和A0值。

由圖6可知，所得的擬合方程為lnk=-4 872.24/T+7.46，R2=0.872 5。通過擬合方程可以計算出MAE過程中的活化能Ea為40.51 kJ/mol，A0為1 737.15。微波萃取的活化能比溶劑萃取[18]的低。結果表明微波能降低萃取體系內的Ea，從而強化植物細胞內活性成分的提取。

圖6 不同溫度與提取速率常數擬合關系Figure 6 Fitting relationship between different temperature and extraction rate constant

2.4 花色苷提取的熱力學分析

根據式(16)作lnK與1/T圖，直線斜率為-ΔH/R，截距為ΔS/R(圖7)。由圖7可知，線性擬合的回歸方程為lnK=22.93-5.06/T，R2=0.993 0，擬合曲線的斜率為-ΔH/R，截距為ΔS/R，通過回歸方程計算得出ΔH為42.07 J/mol和ΔS為190.64 J/mol。在MAE過程中ΔH和ΔS均大于零，說明MAE屬于吸熱熵增加的過程。

圖7 不同溫度與分配系數的擬合關系Figure 7 Fitting relationship between different temperatures and distribution coefficient

由表5可知，隨萃取溫度增加，ΔG逐漸減小，且均小于零，說明微波在不同溫度下提取過程是一個自發過程。

表5 花色苷提取過程中自由能變Table 5 Free energy changes for anthocyanins extractionat different temperatures

3 結論

通過響應面耦合遺傳算法優化微波輔助萃取藍莓花色苷的工藝，得到最優工藝參數為萃取溫度60 ℃、萃取時間8 min、乙醇體積分數57%和料液比1∶32 (g/mL)，花色苷萃取率(83.15±2.03)%；通過微波輔助萃取藍莓花色苷的動力學模型發現提取速率常數隨萃取溫度的增加而增大；在微波輔助萃取過程中，Ea、ΔS和ΔH分別為40 510.00，42.07，190.64 J/mol，ΔG小于零，說明微波輔助萃取過程屬于吸熱、熵增加、自發的過程。