高效液相色譜法檢測藥品糖漿劑中4種人工合成甜味劑

鐘菲菲 雷德卿 周金沙 劉 波 王子倩

(長沙市食品藥品檢驗所，湖南 長沙 410008)

人工合成甜味劑是一類應用較廣泛的食品添加劑，主要有糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、愛德萬甜、甜蜜素、三氯蔗糖等[1]。過量攝入人工合成甜味劑可能損害人的肝臟、神經、消化系統，甚至引發癌癥[2-4]，嬰幼兒更容易受到不可逆損傷[5]。

食品中人工合成甜味劑檢測手段較多[4,6]，主要有毛細管電泳法[7]、離子色譜法[8]、氣相色譜法[9]、高效液相色譜法[10-13]、高效液相色譜-質譜聯用法[14-16]等。毛細管電泳法及離子色譜法靈敏度低，重現性差，易受樣品中其他組分干擾；氣相色譜法通常需要柱前衍生化，操作較繁瑣；高效液相色譜—質譜法儀器昂貴，且受樣品基質影響明顯。目前食品國家安全標準主要是檢測單組分的甜味劑，往往一個方法適用于一種組分，同時檢測多種非法添加食品甜味劑的方法尚未見諸于報道。因此，亟需建立一種準確簡單的方法同時測定多種人工合成甜味劑。

小兒止咳糖漿以藥食同源的甘草和桔梗等為原料，處方中蔗糖含量為65 g/100 mL[17]。但藥用輔料蔗糖來源于天然產物，價格昂貴，因此一些商家為降低成本使用糖精鈉等人工合成甜味劑替代蔗糖。研究擬以小兒止咳糖漿為例，在探索前處理方法的基礎上，建立高效液相色譜法同時測定藥品糖漿劑中安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、愛德萬甜4種食品甜味劑，以期為食品甜味劑安全研究和風險評估提供參考，為科學監管提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈：色譜純，批號JA110130，美國默克公司；

甲醇：色譜純，批號L1147507 117，德國默克公司；

超純水：自制并經檢測符合規定；

小兒止咳糖漿樣品：來源于21家生產企業共45批次；

安賽蜜標準品：純度99.4%，批號G1012337，德國Dr. Ehrenstorfer公司；

糖精鈉標準品：純度86.2%，批號510208-202001，德國Dr. Ehrenstorfer公司；

阿斯巴甜標準品：純度95.0%，批號510206-202001，德國Dr. Ehrenstorfer公司；

愛德萬甜標準品：純度97.0%，批號102278222，德國Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 主要儀器設備

高效液相色譜儀：Waters alliance e2695型，美國Waters公司；

電子分析天平：METTLER XS205DU型，瑞士梅特勒—托利多公司；

純化水系統：Millipore Milli-Q Direct 8型，美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱為Shiseido AQ-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，以乙腈為流動相A，以0.02 mol/L磷酸二氫銨(用三乙胺調節pH值至5.5)為流動相B，梯度洗脫(洗脫程序：0 min，2% A，98% B；10 min，5% A，95% B；30 min，45% A，55% B；40 min，45% A，55% B；41 min，2% A，98% B；50min，2% A，98% B)，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長214 nm，進樣量10 μL。

1.3.2 供試品溶液的制備 精密量取糖漿劑樣品1 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇適量，搖勻，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液即可。

1.3.3 對照品溶液的制備 精密稱取安賽蜜25.39 mg，糖精鈉28.88 mg，阿斯巴甜26.27 mg，愛德萬甜25.21 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液(每1 mL含各組分約為1 mg)。精密量取貯備液0.2，0.5，1，1，1，1 mL分別置100，100，100，50，20，10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準曲線工作溶液，每1 mL含各組分約為2，5，10，20，50，100 μg。

1.3.4 樣加標溶液的制備 因無實際樣品同時含安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、愛德萬甜4種組分，取一批樣品45 mL，加上述貯備液5 mL，渦旋混勻，其余按2.2項同法操作，作為樣加標溶液(每1 mL含各組分約為100 μg)，備用。

2 結果與分析

2.1 前處理方法優化

比較乙腈、水、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、甲醇作為稀釋劑的效果。其中：用乙腈作為稀釋劑時，樣品不能均勻分散，明顯成團；用水、10%甲醇、30%甲醇作為稀釋劑，振搖時產生大量氣泡，久置不散；用50%以上甲醇溶液作稀釋劑，能均勻分散，沒有或產生少量氣泡，靜置即散。由于初始流動相中水相比例高，當樣品溶液有機相濃度過高易引起溶劑效應，故選擇50%甲醇作為稀釋劑。

2.2 色譜條件優化

2.2.1 pH 調節流動相pH值分別為4.5，5.5，6.5，7.5，結果表明pH值5.5時峰形對稱，分離效果良好。4種目標物分子中均含有仲氨基團，愛德萬甜和阿斯巴甜分子中含有羧基，糖精鈉和甜蜜素分子中含磺酸基，均呈現酸堿兩性，在強酸或強堿環境下，分子主要呈解離態，峰形拖尾嚴重，弱酸條件下，分子主要呈游離態，峰形良好，故選擇pH值5.5。

2.2.2 磷酸二氫銨濃度 比較了流動相中不同磷酸二氫銨濃度(0.005，0.010，0.020，0.050，0.100 mol/L)下的峰形和分離效果，結果：0.005,0.010 mol/L的分離效果和峰形均較差，0.020,0.050,0.100 mol/L的分離效果和峰形均良好，考慮鹽濃度過高對儀器和色譜柱的損傷，故選擇0.020 mol/L的磷酸二氫銨。

2.2.3 色譜柱型號 考察4個品牌型號的色譜柱(Waters symmetry-C18、Agilent TC-C18、Inerstil ODS-SP-C18、Shiseido AQ-C18，規格均為4.6 mm×250 mm, 5 μm)對分離效果的影響，分離效果均良好，由于AQ-C18柱耐高水相，建議選用。

2.2.4 流速 比較丁流動相流速對峰形和分離效果。結果表明：流動相流速過低，縱向分子擴散嚴重，影響峰形和分離效能，提高流速可以有效減少縱向分子擴散，改善峰形提高分離效能；但流速過高，會增加傳質阻力，降低分離效能，且會增加柱壓損壞色譜柱。其他條件不變，流速在0.8～1.2 mL/min范圍內，縱向分子擴散與傳質阻力達到較好的平衡狀態，4種待測組分分離良好。

2.2.5 柱溫 考察了柱溫(30,35,40 ℃)對色譜分離效果的影響，結果顯示在試驗范圍內柱溫對分離效果、保留時間、峰形、柱壓影響不大。提高柱溫，雖然可以減少流動相黏滯性，但對于降低傳質阻力作用并不明顯，而4種待測組分熱穩定性好，無需控制低溫，因此無需嚴格控制柱溫，建議使用柱溫箱保持柱溫恒定即可。

2.3 線性范圍、檢出限與定量限

取標準曲線工作溶液，按1.3.1的色譜條件測定4個組分，以質量濃度(mg/L)為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線。安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、愛德萬甜4種組分在質量濃度為2～100 mg/L范圍內線性關系良好，相關系數R2均大于0.999。以信噪比S/N=3計算檢出限，S/N=10計算定量限，4種組分線性范圍與檢測限見表1。由表1可知，檢出限和定量限均較低，可見該法靈敏度較好。

表1 4種組分線性范圍與檢測限Table 1 Linearity range and detection limit of four components (n=6)

2.4 專屬性

取經檢測不含4種待測成分的小兒止咳糖漿樣品溶液、樣加標溶液、混合對照品溶液，按1.3.1的色譜條件進樣檢測，結果如圖1所示，4種組分峰形對稱，分離良好，保留時間合適，樣品中其他成分沒有干擾。

2.5 精密度試驗

取混合對照品溶液，連續進樣6次，結果見表2，4種組分RSD均小于4%(n=6)，說明儀器精密度良好。

表2 精密度試驗 Table 2 The test of precision (n=6)

2.6 穩定性試驗

取樣加標溶液，在0，2，4，8，12，16，20， 24 h進樣，平行進2針，以2針的平均峰面積計算，結果見表3，RSD均小于4%(n=8)，說明供試品溶液至少在24 h內穩定，制備后24 h內進樣分析不影響結果。

表3 穩定性試驗Table 3 The test of stability (n=8)

2.7 重復性試驗

取樣品(批號：170403)，按1.3.2的方法平行制備供試品溶液6份，按1.3.1的色譜條件測定，結果表明所建立方法重復性良好(見表4)。

表4 重復性試驗Table 4 The test of repeatability (n=6)

2.8 回收率試驗

精密量取供試品(批號：170403)1 mL，置10 mL容量瓶中，平行量取9份，分為高、中、低3個組，高、中、低組分別精密加入100 μg/mL的混合對照品溶液1.2，1.0，0.8 mL，置振蕩器混勻，按1.3.2的方法制備供試品溶液。

1. 安賽蜜 2. 糖精鈉 3. 阿斯巴甜 4. 愛德萬甜圖1 4種目標物的色譜圖Figure 1 Chromatogram of 4 kinds of target compounds

精密量取10 μL供試品溶液注入液相色譜儀，依法測定，按式(1)計算回收率。

(1)

式中：

p——回收率，%；

m1——測得加標樣品中待測組分的質量，μg；

m2——樣品中含待測組分的質量，μg；

m0——加入待測組分標準物質的質量，μg。

由表5可知，安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、愛德萬甜平均回收率分別為98.65%，104.09%，100.96%，102.30%，RSD分別為1.4%，0.8%，1.4%，1.7%(n=9)，說明所建立的方法回收率良好，準確度高。

表5 回收率試驗Table 5 The test of recovery (n=9)

2.9 樣品測定

按1.3.2的樣品制備方法和1.3.1的下色譜條件，測定45批次樣品，對樣品中出現與對照品保留時間一致的色譜峰，進行純度測試和光譜指數圖一致性比較，能通過純度測試且與相應對照品光譜指數圖一致，判定為檢出，其中3批次檢出愛德萬甜，2批次檢出阿斯巴甜和愛德萬甜，結果見表6，其他均未檢出。

表6 樣品測定結果Table 6 The results of sample determination mg/L

3 結論

建立了糖漿劑藥品中人工合成甜味劑含量測定方法，該方法可同時測定安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、愛德萬甜4種組分，專屬性好、準確可靠、操作簡單、線性范圍寬，可用于糖漿劑質量安全監測。下一步將繼續探索液相色譜—質譜聯用定性方法，以液相色譜定量結合液質聯用定性建立補充檢驗方法監測糖漿劑藥品中非法添加人工合成甜味劑。