QuEChERS-氣相色譜—三重四極桿質(zhì)譜法測定辣條中16種多環(huán)芳烴

李 莎 曾習(xí)文 申 睿 李亦蔚 譚 震

(1. 食品安全監(jiān)測與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410000；2. 長沙縣食品藥品安全檢測中心，湖南 長沙 410100)

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是指分子中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的芳香環(huán)的非極性或中等級(jí)性有機(jī)化合物[1]。食品中多環(huán)芳烴來源廣泛，一方面由被污染的水、空氣和土壤通過食物鏈遷移在食品原料中富集[2-3]；另一方面，食品原料在高溫烹調(diào)加工時(shí)會(huì)發(fā)生熱解或熱聚反應(yīng)，形成PAHs[4-6]。PAHs具有很強(qiáng)的致癌性和基因毒性，嚴(yán)重影響生命健康，引起了世界各國的廣泛關(guān)注，已被列為污染嚴(yán)重的持久性污染物[7-9]。

國內(nèi)外報(bào)道的食品中多環(huán)芳烴的檢測對(duì)象多以苯并[α]芘、PAH4(苯并[α]芘、苯并[b]熒蒽、苯并[α]蒽、屈)為主，涉及氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[10]、高效液相色譜法[11-13]和氣相色譜—三重四級(jí)桿質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[14-15]等。與前兩種方法相比，氣相色譜—三重四級(jí)桿質(zhì)譜法(GC-MS/MS)選擇性好、檢測靈敏度高，適用于復(fù)雜基質(zhì)中痕量化合物的定性和定量分析。食品中多環(huán)芳烴的含量較低，有效提取多環(huán)芳烴尤為困難，因此樣品的前處理是整個(gè)檢測過程中最關(guān)鍵且最耗時(shí)的環(huán)節(jié)。已報(bào)道的前處理方法主要有索氏提取[16]、液液萃取[5]、固相萃取凈化[10]、凝膠滲透色譜凈化[17]、QuEChERS法[14]等。其中，QuEChERS技術(shù)具有操作簡便、快速、成本低、消耗有機(jī)溶劑少等優(yōu)點(diǎn)，近年來在污染物殘留檢測等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[18-19]。

辣條是一種廣受青睞的休閑小食品，以面粉、香辛料、食用油等為主要原料，通過擠壓膨化和調(diào)味制成。辣條生產(chǎn)過程中的擠壓膨化和調(diào)味油制作環(huán)節(jié)需經(jīng)高溫烹制，由此可能帶來PAHs污染。目前有關(guān)QuEChERS結(jié)合GC-MS/MS技術(shù)檢測辣條中16種多環(huán)芳烴的分析方法鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。研究擬采用QuEChERS前處理方法結(jié)合GC-MS/MS檢測技術(shù)開發(fā)一種快速測定辣條中16種多環(huán)芳烴的檢測方法，并對(duì)20批次市售辣條樣品進(jìn)行檢測，旨在為辣條中多環(huán)芳烴污染風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警和質(zhì)量安全監(jiān)管提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料與試劑

16種多環(huán)芳烴混標(biāo)(包含萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯并[α]蒽、屈、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[α]芘、茚并[1,2,3-c,d]芘、二苯并[α,h]蒽、苯并[g,h,i]芘)：200 μg/mL，溶劑為正己烷，北京壇墨質(zhì)檢有限公司；

正己烷、乙酸乙酯、乙腈：色譜純，德國默克公司；

PSA：粒徑40～63 μm，100 g/瓶，上海安譜實(shí)驗(yàn)科學(xué)股份有限公司；

十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)：粒徑40～75 μm，100 g/瓶，上海安譜實(shí)驗(yàn)科學(xué)股份有限公司；

中性氧化鋁：粒徑125 μm，100 g/瓶，上海迪馬科技有限公司；

Agilent J&W DB-EUPAH毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)：美國Agilent公司；

辣條樣品：市售。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

氣相色譜—三重四極桿質(zhì)譜儀：Agilent 7890B-7000C型，美國Agilent公司；

超聲波清洗儀：KQ-500B型，昆山市超聲儀器有限公司；

渦旋振蕩器：XH-B型，江蘇健康醫(yī)療用品有限公司；

冷凍離心機(jī)：Eppendorf 5804R型，德國艾本德股份公司；

樣品濃縮儀：HN132型，濟(jì)南海能儀器有限公司；

高速多功能粉碎機(jī)：XY-100型，浙江省永康市松青五金廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確移取0.5 mL 16種PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中，用正己烷溶劑配置成10 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。精確移取一定量的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用正己烷溶劑或空白基質(zhì)提取液逐級(jí)釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液或基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液，質(zhì)量濃度分別為0.005，0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50 μg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 儀器分析條件

(1) 色譜條件：Agilent J&W DB-EUPAH毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣(99.999%)；柱流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度為300 ℃；程序升溫：初始溫度40 ℃保持2 min，以50 ℃/min升溫至200 ℃，再以5 ℃/min升溫至300 ℃，保持15 min；進(jìn)樣量為1 μL；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣。

(2) 質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊離子源(EI)；電離能量70 eV；離子源溫度300 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；傳輸線溫度300 ℃；掃描模式為多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。16種 PAHs的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.2.3 樣品前處理

(1) 提取：稱取粉碎的辣條樣品5.0 g置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩2 min，再加入QuEChERS鹽析劑(含1.0 g NaCl和4.0 g無水硫酸鎂)，渦旋振蕩2 min，超聲輔助提取10 min，-20 ℃冷凍30 min，于4 000 r/min冷凍離心3 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，按上述過程重復(fù)提取一次，合并上清液。

(2) 凈化：移取提取液約6 mL，置于15 mL離心管中，加入QuEChERS凈化劑(其中吸附劑為100 mg PSA，100 mg C18和1 000 mg中性氧化鋁)，渦旋振蕩2 min，再于4 000 r/min冷凍離心3 min，準(zhǔn)確移取上清液4.0 mL于10 mL離心管中，40 ℃氮吹至近干，用正己烷溶解并定容至1.0 mL，過0.22 μm有機(jī)濾膜，供GC-MS/MS分析檢測，采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。

(3) 優(yōu)化試驗(yàn)：在空白辣條樣品中添加100 μg/kg 16種 PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制成加標(biāo)樣品，按照上述方法進(jìn)行檢測，分別單獨(dú)考察提取溶劑(正己烷、乙酸乙酯、乙腈)、超聲輔助提取時(shí)間(0，5，10，20 min)、凈化填料種類和用量(1號(hào)：100 mg PSA；2號(hào)：100 mg PSA+100 mg C18；3號(hào)：100 mg PSA+200 mg C18；4號(hào)：100 mg PSA+100 mg C18+1 000 mg 中性氧化鋁)對(duì)辣條中16種PAHs提取效果的影響。

1.2.4 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià) 按照建立的方法，在相同的條件下同時(shí)測定不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液、基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按式(1)計(jì)算各組分的基質(zhì)效應(yīng)(ME值)[20]。

ME=(B-A)/A×100%，

(1)

式中：

ME——基質(zhì)效應(yīng)(ME值)，%；

A——溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；

B——基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.2.5 線性關(guān)系 通過測定不同濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別以16種PAHs的峰面積為縱坐標(biāo)、各濃度點(diǎn)為橫坐標(biāo)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 檢出限及定量限的測定 在空白辣條樣品中添加一定濃度的16種PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3倍信噪比(S/N=3)時(shí)對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物濃度計(jì)算得到方法檢出限，以10倍信噪比(S/N=10)計(jì)算得到方法定量限。

1.2.7 回收率和精密度測定 在空白辣條樣品中分別添加16種PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為10，20，100 μg/kg，每個(gè)水平平行測定6次，分別計(jì)算平均回收率和精密度。

1.2.8 實(shí)際樣品測定 按照建立的方法對(duì)市售20批次辣條中16種PAHs含量進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Agilent Mass Hunter軟件對(duì)16種PAHs進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)處理；用Excel軟件對(duì)條件優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)、基質(zhì)效應(yīng)、回收率、精密度及樣品含量水平數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

采用氣質(zhì)聯(lián)用方法分析PAHs時(shí)，通常采用HP-5MS或DB-EUPAH柱。由于苯并[b]熒蒽和苯并[k]熒蒽為同分異構(gòu)體，茚并[1,2,3-c,d]芘與二苯并[α,h]蒽結(jié)構(gòu)相似，在傳統(tǒng)的HP-5MS上無法完全分離。選用DB-EUPAH色譜柱對(duì)16種PAHs進(jìn)行分離，在優(yōu)化后的色譜條件下16種PAHs可以實(shí)現(xiàn)分離，且峰型相對(duì)尖銳窄小。

采用全掃描模式對(duì)16種PAHs進(jìn)行掃描，得到總離子流圖，根據(jù)質(zhì)譜圖選擇2～3個(gè)特征離子作為母離子。對(duì)選定的母離子進(jìn)行子離子掃描，選擇信噪比較高的特征離子對(duì)分別作為定性、定量離子對(duì)，同時(shí)優(yōu)化碰撞能量。優(yōu)化后的16種PAHs多反應(yīng)監(jiān)測模式質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間如表1所示，GC-MS/MS方法測定16種PAHs基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1。

表1 16種多環(huán)芳烴化合物的保留時(shí)間及MRM參數(shù)Table 1 Retention time and MRM parameters of 16 kinds of PAHs compounds

2.2 樣品前處理方法的考察

2.2.1 提取溶劑的選擇 由于辣條基質(zhì)復(fù)雜，含有脂肪、糖類、色素等干擾物質(zhì)較多，為了能盡可能地提高16種PAHs的提取效率、降低基質(zhì)干擾，需要對(duì)提取溶劑種類進(jìn)行優(yōu)化。分別采用正己烷、乙酸乙酯、乙腈對(duì)16種PAHs加標(biāo)量為100 μg/kg的辣條樣品進(jìn)行提取，按照1.2.3的方法凈化濃縮后測定目標(biāo)物的含量，通過回收率結(jié)果來比較不同溶劑的提取效果。

1. 萘 2. 苊烯 3. 苊 4. 芴 5. 菲 6. 蒽 7. 熒蒽 8. 芘 9. 苯并[α]蒽 10. 屈 11. 苯并[b]熒蒽 12. 苯并[k]熒蒽 13. 苯并[α]芘 14. 茚并[1,2,3-c,d]芘 15. 二苯并[α,h]蒽 16. 苯并[g,h,i]芘圖1 16種多環(huán)芳烴混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.20 μg/mL)的色譜圖Figure 1 The chromatograms of 16 kinds of PAHs mixed matrix standard solutions (0.20 μg/mL)

如圖2所示，乙腈作為提取溶劑時(shí)回收率明顯高于其他溶劑，達(dá)70.43%～103.30%。由于PAHs是一類極性較弱的脂溶性化合物，采用正己烷、乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)，提取液中油脂含量高，凈化后的樣品中油脂不能完全除盡，上機(jī)分析時(shí)會(huì)對(duì)GC-MS/MS系統(tǒng)造成污染，影響儀器的穩(wěn)定性；另外提取液中含油脂，由于沸點(diǎn)較高，在進(jìn)樣口可能存在氣化不完全的現(xiàn)象，導(dǎo)致結(jié)果偏低。因此，選擇乙腈作為優(yōu)化的提取溶劑。

圖2 提取溶劑對(duì)辣條中16種多環(huán)芳烴提取效果的影響Figure 2 Effect of different solvents on the extraction efficiency of 16 kinds of PAHs in spicy strip

2.2.2 超聲輔助提取時(shí)間優(yōu)化 分別設(shè)置4個(gè)不同的超聲提取時(shí)間0，5，10，20 min，按照1.2.3對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行測定，考察超聲時(shí)間對(duì)提取效率的影響。由圖3可知，在超聲輔助提取條件下的提取效果優(yōu)于未超聲提取的，超聲時(shí)間從0 min延長到10 min回收率均明顯升高。超聲時(shí)間從10 min延長到20 min時(shí)，各組分的回收率變化不大，且部分組分回收率下降。最終選擇超聲輔助提取時(shí)間為10 min。

圖3 超聲提取對(duì)辣條中16種多環(huán)芳烴提取效率的影響Figure 3 Effect of ultrasonic extraction on extraction efficiency the of 16 kinds of PAHs in spicy strip

2.2.3 凈化填料的優(yōu)化 選擇QuEChERS方法對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化處理，常用的凈化填料包括PSA、C18、中性氧化鋁等。PSA可有效去除樣品中有機(jī)酸、糖類、脂肪酸和少量色素等；C18對(duì)極性弱的脂肪酸、色素等大分子物質(zhì)有較強(qiáng)的吸附效果；中性氧化鋁常用于非極性劑及中等極性物質(zhì)的吸附，具有很好的除脂能力[21]。凈化試劑及其用量根據(jù)不同基質(zhì)類型來選擇，辣條提取液中基質(zhì)一般為糖類、脂類、酸和色素等。研究主要考察了PSA、C18、中性氧化鋁不同配比的凈化填料對(duì)樣品的凈化效果，4組填料凈化后16種PAHs的回收率結(jié)果見圖4。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，隨著填料中凈化試劑種類及含量增加，溶液越來越澄清，但回收率結(jié)果不一。隨著C18凈化試劑用量的增大，16種PAHs的回收率降低，推斷可能由于C18吸附性較強(qiáng)，除雜的同時(shí)也會(huì)吸附待測化合物，C18的用量過大，反而造成待測化合物的回收率偏低。對(duì)比4組凈化填料凈化后的回收率結(jié)果，4號(hào)凈化填料(100 mg PSA+100 mg C18+1 000 mg中性氧化鋁)最優(yōu)，推斷可能中性氧化鋁去除油脂效果好，有利于基質(zhì)的凈化。因此，選擇4號(hào)凈化填料作為優(yōu)化的QuEChERS凈化填料。

1號(hào). 100 mg PSA 2號(hào). 100 mg PSA+100 mg C18 3號(hào). 100 mg PSA+200 mg C18 4號(hào). 100 mg PSA+100 mg C18+1 000 mg 中性氧化鋁圖4 4組凈化填料凈化后16種PAHs回收率Figure 4 Recover rates of 16 kinds of PAHs after purification by four groups of purification packings

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

采用正己烷溶劑和空白基質(zhì)提取液分別配制成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，質(zhì)量濃度分別為0.005，0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50 μg/mL。在相同條件下進(jìn)行檢測，按照1.2.4中式(1)計(jì)算ME值，通過ME值判斷基質(zhì)效應(yīng)[20]。由表2可知，16種組分的ME值在0.50%～23.23%，其中萘、苯并[α]蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[α]芘的ME值均高于10%，表明基質(zhì)效應(yīng)顯著，辣條中16種PAHs測定方法需利用基質(zhì)匹配外標(biāo)法校正來消除基質(zhì)效應(yīng)，進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

2.4 線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和檢出限

采用基質(zhì)空白將16種PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)中間液配制成7個(gè)不同質(zhì)量濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別為0.005，0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50 μg/mL。采用建立的方法進(jìn)行測定，以16種目標(biāo)物的響應(yīng)面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表2所示，16種PAHs在0.000 5～0.50 μg/mL濃度范圍線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.998 4～0.999 9。分別以信噪比S/N為3和10所對(duì)應(yīng)的濃度，計(jì)算各組分的檢出限和定量限，該方法檢出限在0.04～0.55 μg/kg，定量限在0.12～1.85 μg/kg(見表2)。

表2 辣條中16種多環(huán)芳烴的線性方程、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限、定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients, matrixeffects (MEs), limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ) of 16 kinds of PAHs in spicy strip

2.5 方法的回收率和精密度

在空白樣品中分別添加16種PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制成10，20，100 μg/kg三水平加標(biāo)樣品，渦旋振蕩2 min，靜置2 h后，以建立的方法進(jìn)行測定，每個(gè)水平平行測定6次，結(jié)果如表3所示，平均回收率為71.54%～103.70%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.4%～9.3%。

2.6 實(shí)際樣品測定

采用該方法對(duì)隨機(jī)抽取的20批次辣條樣品中16種多環(huán)芳烴含量進(jìn)行測定，結(jié)果如表4所示，在14批次樣品中檢測出多環(huán)芳烴，除苊烯、蒽、苯并[b]熒蒽、茚并[1,2,3-c,d]芘、二苯并[α,h]蒽、苯并[g,h,i]芘未檢出外其他種類多環(huán)芳烴均有檢出。其中萘的平均含量最高，達(dá)8.27 μg/kg；其次是菲，平均含量為4.73 μg/kg，20批次樣品中多環(huán)芳烴總含量范圍為0.42～42.28 μg/kg，平均總含量為11.12 μg/kg。通過實(shí)際樣品檢測，辣條中多環(huán)芳烴有不同程度檢出，應(yīng)引起食品安全監(jiān)管部門重視。

表4 辣條樣品中多環(huán)芳烴含量Table 4 The content of PAHs in spicy strip samples μg/kg

3 結(jié)論

試驗(yàn)將QuEChERS前處理方法結(jié)合GC-MS/MS檢測技術(shù)應(yīng)用于辣條中16種多環(huán)芳烴的快速分析檢測。結(jié)果表明，在0.005～0.50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均達(dá)0.998 4以上，檢出限和定量限分別在0.04～0.55 μg/kg和0.12～1.85 μg/kg；空白樣品中10，20，100 μg/kg三水平的平均加標(biāo)回收率為71.54%～103.70%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～9.3%。該方法簡單、快速、選擇性好、靈敏度高，能夠滿足辣條中16種多環(huán)芳烴的日常檢測要求。隨機(jī)抽取的20批次辣條樣品中有14批次檢出多環(huán)芳烴，下一步工作中將對(duì)辣條中多環(huán)芳烴污染來源和影響因素進(jìn)行進(jìn)一步研究。