HPLC法測定扶正化瘀片中五味子醇甲、乙含量

張玉杰 謝富玲 付慶帥 李榮勝 潘一峰，2

（1. 上海黃海制藥有限責(zé)任公司 上海 200942；2. 上海現(xiàn)代中醫(yī)藥股份有限公司 上海 200050）

扶正化瘀片是由五味子、桃仁、絞股藍(lán)、丹參、發(fā)酵蟲草菌粉和松花粉六味藥材組成的復(fù)方中成藥。具有活血祛瘀、益精養(yǎng)肝的功效，用于乙型肝炎肝纖維化屬瘀血阻絡(luò)、肝腎不足證者[1]。五味子作為使藥，含有豐富的木脂素成分，其中五味子醇甲、乙是主要的藥效成分[2-5]。目前《中國藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)五味子僅以五味子醇甲作為含量控制成分[6]，而USP 41/NF36 在此基礎(chǔ)上增加了五味子醇乙等4 個成分的含量控制[7]。扶正化瘀片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅以五味子甲素的TLC 的鑒別作為判斷依據(jù)，很難準(zhǔn)確地表征木脂素成分的含量。同時扶正化瘀片成分復(fù)雜，很多成分極性相近或?qū)偻之悩?gòu)體，其中戈米辛D、J 出峰位置與五味子醇甲、乙也十分接近，采用已報道的HPLC 方法[8]流動相體系測定扶正化瘀片中五味子醇甲、乙的含量存在分離度和積分值重現(xiàn)性差，甚至目標(biāo)峰和其他成分完全重合為共流峰的現(xiàn)象，從而影響準(zhǔn)確定量。另外劉珊等[9]、邢心睿等[10]采用UPLCMS/MS 和UHPLC-Q-TOF/MS 技術(shù)測定人體口服扶正化瘀片后在血漿中檢測到以原型化合物入血成分有五味子醇甲、乙等多種化合物，得到較明顯的血藥濃度與時間曲線及藥代動力學(xué)參數(shù)。因此建立適合扶正化瘀片中五味子醇甲、乙含量測定方法有助于扶正化瘀制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升，為藥理、毒理研究提供可靠的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1）儀器 Agilent 1260ⅠⅠ高效液相色譜儀、Agilent Zorbax Extend C18柱（4.6 mm × 250 mm， 5 μm）［安捷倫科技（中國）有限公司］；XP-105 電子天平［梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司］；HWS-28 恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；SK7200 LHC 超聲清洗儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

2）試劑與藥物 五味子醇甲（批號110857-201815，純度99.7%，中國食品藥品檢定研究院）；五味子醇乙（批號3249，純度98.0%，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）；扶正化瘀片0.8 g（批號S200404，上海黃海制藥有限責(zé)任公司）；甲醇為HPLC 級（上海星可高純試劑有限公司）；純水自制。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

采用Agilent Zorbax Extend C18色譜柱；流動相為甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～55 min，55% A；55～57 min，55%～90% A；57～60 min，90% A；60～62 min，90%～55% A；62～65 min，55% A）；流速1.0 mL/min；檢測波長250 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2 對照品溶液制備

精密稱取對照品五味子醇甲24.00 mg、五味子醇乙16.00 mg，分別置10 mL 量瓶中，加70%甲醇溶解，定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為2.39、1.57 mg/mL 對照品儲備液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 供試品溶液的制備

取本品10 片稱重，研細(xì)，混勻，取約1.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理15 min，放冷，再稱定重量，加70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4 專屬性實(shí)驗(yàn)

取供試品、混合對照品溶液、陰性供試品溶液（除去五味子提取物）以及五味子提取物供試品溶液，進(jìn)行色譜測定。

1.2.5 線性實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取2 種對照品溶液適量，置于不同規(guī)格容量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，配制成6 個不同濃度的混標(biāo)溶液，進(jìn)行色譜測定。

1.2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

在不同日期，采用不同儀器，由兩位實(shí)驗(yàn)員平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)行色譜測定。

1.2.7 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

分別精密稱取本品0.75 g，置具塞錐形瓶中，精密加入上述對照品混標(biāo)儲備液5、10、15 mL，精密加入15、10、5 mL 70%甲醇，搖勻，稱重，超聲處理15 min，放冷，再稱重，加70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，平行制備3 份即得低、中、高濃度準(zhǔn)確度測定溶液，進(jìn)行色譜測定。

1.2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液和同一對照品溶液，于25 ℃下分別存放0、6、12、24、48 h，進(jìn)行色譜測定。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

樣品中五味子醇甲、乙色譜峰與其他峰能達(dá)到基線分離。空白溶液與陰性供試品溶液在對照品保留時間處無干擾峰，供試品溶液在與對照品溶液相同保留時間位置出峰，且待測成分與鄰近干擾峰分離度大于1.5，表明該方法專屬性良好（圖1）。

圖1 HPLC色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察

以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，五味子醇甲：y=39 974.00x－58.30，r=0.999 9，線性范圍0.024 0～1.203 4 mg/mL；五味子醇乙：y=33 093.60x－126.43，r=0.999 9，線性范圍0.015 7～0.784 5 mg/mL，兩成分在各自濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度（重復(fù)性、中間精密度）

實(shí)驗(yàn)員1 測定平行6 份樣品中五味子醇甲、乙的平均含量分別為0.206%（RSD 0.59%）、0.052%（RSD 1.94%）；實(shí)驗(yàn)員2 測定平行6 份樣品中五味子醇甲、乙的平均含量分別為0.205%（RSD 0.43%）、0.053%（RSD 0.95%）；表明精密度良好。

2.4 準(zhǔn)確度

低、中、高水平樣品中五味子醇甲的平均加樣回收率為105.63%（RSD 0.90%，n=9）；五味子醇乙平均加樣回收率為103.24%（RSD 3.81%，n=9），表明方法準(zhǔn)確度良好（表1）。

表1 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

供試品及對照品溶液中五味子醇甲、乙的峰面積RSD 分別為0.49%、1.84%；0.68%、0.95%。表明對照品與供試品溶液中待測成分在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 含量測定

根據(jù)建立的方法對10 批次不同批號的扶正化瘀片進(jìn)行五味子醇甲、乙含量測定，被測組分色譜峰與其他峰能達(dá)到基線分離，峰形尖銳對稱、重現(xiàn)性良好，五味子醇甲、乙含量范圍分別在0.093%～0.181%、0.025%～0.056%（表2）。

表2 扶正化瘀片中五味子醇甲、乙含量

3 討論

在色譜條件優(yōu)化研究中，參考陳立柱等[8]、劉晶等[11]、支旭然等[12]、王艷等[13]已發(fā)表的文獻(xiàn)對乙腈-水、甲醇-水流動相體系調(diào)整比例后均進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)不同流動相體系下，均能達(dá)到目標(biāo)化合物的有效分離，但是甲醇-水體系下五味子醇甲、乙的出峰時間更短，出于縮短分析時間、節(jié)約成本的角度，選擇甲醇-水作為色譜測定的流動相體系。

對五味子醇甲、乙對照品溶液進(jìn)行全波長（200 ～400 nm）掃描，五味子醇甲、乙分別于210、250 nm 處有最大吸收，250 nm 波長下基線平穩(wěn)、目標(biāo)峰周圍干擾峰少且響應(yīng)低，結(jié)合《中國藥典》2020 年版及相關(guān)文獻(xiàn)，最終選擇250 nm 為檢測波長。

考察了流動相中添加劑（0.1%甲酸、0.1%磷酸、2 mmol/L 乙酸銨）對五味子醇甲、乙的色譜峰面積、理論塔板數(shù)、分離度、拖尾因子的影響。研究表明，以磷酸為添加劑（濃度0.1%）時，五味子醇乙峰與雜質(zhì)峰（戈米辛J）分離度不佳，其余添加劑對分析結(jié)果無顯著性影響，結(jié)合目標(biāo)化合物本身性質(zhì)，選擇不添加任何添加劑，以水-甲醇體系作為流動相按一定的比例梯度洗脫。

考察了不同柱溫（20、25、30、35 ℃）對五味子醇甲、乙的色譜峰面積及相關(guān)參數(shù)的影響。結(jié)果表明，各柱溫對分析結(jié)果無明顯影響，為便于控制柱溫，選擇柱溫為30 ℃。

在準(zhǔn)確度考察研究中，高濃度下五味子醇乙測得的回收率略高，其原因是由于五味子醇乙含量較低。參照《中國藥典》2020 年版四部＜ 9101＞分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，其回收率為85%～110%，仍符合相關(guān)要求。

綜上所述，本研究建立了HPLC 方法測定扶正化瘀片中五味子醇甲、乙含量，有助于扶正化瘀片及相關(guān)劑型的質(zhì)量控制，可為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升、藥理及毒理研究提供參考依據(jù)。該分析方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、耐用性良好、操作簡便且符合方法驗(yàn)證相關(guān)要求。