奶牛源G10P［11］型A群輪狀病毒的分離鑒定

卜 嫻，湯 承，岳 華

（西南民族大學畜牧獸醫學院，四川 成都 610041）

牛A群輪狀病毒（Bovine Rotavirus A，BRVA）在犢牛腹瀉中占有重要地位，是引起犢牛腹瀉的主要病原之一，2 月齡以內犢牛最易感，呈世界性流行［1-2］。BRVA 是一種分節段的雙鏈RNA 病毒，為呼腸弧病毒科輪狀病毒屬成員，病毒子直徑為60～80 nm［3］。BRVA 基因組大小約為18 kb，含有11 個基因節段，編碼6 個結構蛋白（VP1～VP4、VP6、VP7）和6 個非結構蛋白（NSP1～NSP6）［4］。輪狀病毒有多種基因型，通常用GxP［x］表示，其中G 型和P型分別是由VP7和VP4基因序列決定的［5］。研究顯示，BRVA至少有14種G型和14種P型，我國發現的BRVA 基因型有G6、G8、G10 和P［1］、P［5］、P［11］，G 型和P 型可組合成不同的基因型，這讓BRVA 基因型變得更為復雜。不同基因型毒株之間的交叉免疫保護效果差。因此，了解我國牛群中BRVA 的流行情況及基因型，對BRVA感染的防治至關重要。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本及材料 7份BRVA陽性犢牛腹瀉糞便樣本來自四川某奶牛場，MA-104 傳代細胞系、兔抗BRVA 陽性血清由西南民族大學動物醫學實驗室提供；TrizolTMReagent 購于TaKaRa 公司；反轉錄試劑盒購于成都市蓉為基因生物科技有限公司。

1.2 病毒的分離 按照文獻［6］報道的方法，將BRVA 陽性糞便樣本接種到MA-104進行病毒的分離培養，觀察細胞病變。

1.3 病毒的鑒定

1.3.1 RT-PCR 鑒定 采用周芳等［7］建立的方法對分離株進行BRVA特異性RT-PCR檢測。采用文獻［8-9］報道的分型引物分別去擴增分離株的VP7、VP4基因片段，PCR產物送北京擎科生物科技有限公司測序，并用輪狀病毒分型軟件ViPR鑒定分離株的G、P基因型。

1.3.2 間接免疫熒光鑒定 以兔抗BRVA陽性血清為一抗，按照文獻［6］報道的方法對分離株進行間接免疫熒光鑒定。

1.3.3 電鏡觀察 將分離株的培養物在4 ℃條件下以1 000 r∕min 離心10 min，收集上清液，送至成都里來醫學實驗中心進行透射電鏡觀察。

2 結果

2.1 病毒培養情況 7 份陽性樣本盲傳至第3代，其中有1份出現細胞病變，至第6代細胞病變趨于穩定，接種后24 h 開始出現細胞病變，可見細胞聚集、脫落、拉網等現象（圖1）。

圖1 分離株引起的細胞病變圖（10×40）

2.2 病毒的鑒定

2.2.1 RT-PCR 鑒定 對分離株的1～6 代培養物進行BRVA 特異性RT-PCR 檢測，從中擴增出約231 bp 的條帶（圖2），測序結果經BLAST 比對后證實為BRVA 的特異片段，說明分離株為BRVA。

圖2 分離株RT-PCR檢測結果

2.2.2 分離株的基因型 分離株經分型鑒定，確定為G10P［11］型。

2.2.3 間接免疫熒光鑒定結果 間接免疫熒光鑒定結果顯示，感染細胞胞漿中可見明亮的綠色熒光（圖3），說明該分離株可與BRVA 抗體發生特異性反應，證明分離株為BRVA。

圖3 分離株間接免疫熒光鑒定（10×40）

2.2.4 分離株的形態 電鏡觀察可見直徑為60～80 nm的圓形病毒顆粒，呈典型的“車輪狀”，符合輪狀病毒的形態特征（圖4）。

圖4 分離株病毒子的形態（透射電鏡，150 000×）

綜上可見，本研究成功分離出1 株致細胞病變穩定的奶牛源G10P［11］型BRVA。

3 討論

本研究分離到1株致細胞病變穩定的奶牛源G10P［11］型BRVA毒株，為其遺傳進化和免疫防治等方面的研究提供了材料。我國牛群中存在G6P［1］、G6P［5］、G6P［5］P［11］、G8P［1］、G10G6P［5］、G10P［11］型等多種基因型BRVA毒株感染，優勢基因型為G6P［1］和G6P［5］［10-12］。目前，BRVA 的防控措施主要為疫苗免疫［13-14］，而分離得到BRVA毒株對疫苗的研發至關重要。盡管我國已有關于G6P［1］、G6P［5］、G6P［11］、G8P［1］和G10P［11］型BRVA 毒株的分離報道［6，15-20］，但是G10P［11］型BRVA作為國內的一個流行毒株，對其的分離鑒定報道并不多。常繼濤等人從11份BRVA陽性犢牛腹瀉樣本中分離出1株致細胞病變穩定的奶牛源G10P［11］型BRVA毒株［18］；謝金鑫從10份BRVA陽性犢牛腹瀉樣本中分離出1株致細胞病變穩定的奶牛源G10P［11］型BRVA毒株，并對其基因組特征進行了研究［19］。有關G10P［11］型BRVA毒株的基本生物學特性、致病性及與其他基因型毒株的交叉保護等方面的研究尚未見報道。■