一起藏綿羊溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌混合感染的實驗室診斷

楊雪麗，程玉婷，湯 承，岳 華

（西南民族大學畜牧獸醫學院，四川 成都 610041）

目前，已證實能引起羊呼吸道疾病的常見病毒包括山羊副流感病毒3 型（CPIV3）、牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒（BVDV）、牛冠狀病毒（BCoV）等；常見的細菌包括多殺性巴氏桿菌（Pm）、溶血性曼氏桿菌（Mh）；常見的支原體包括綿羊肺炎支原體（Mo）、絲狀支原體簇成員（Mm Cluster）［1-4］。本研究對一起藏綿羊的呼吸道疾病進行病原確診，以便針對性防治。

1 材料與方法

1.1 發病情況和臨床癥狀 2021 年11 月，四川省甘孜州某藏綿羊養殖場一周內連續有21 只藏綿羊發病，其中死亡8 只，發病率為31%，致死率為38%。患病藏綿羊主要表現為精神不振、發熱、咳嗽、流膿鼻涕、呼吸困難等呼吸道癥狀，部分出現腹瀉癥狀。

1.2 樣本處理 將養殖場送檢的5 份患病藏綿羊深部鼻腔棉拭子浸入滅菌的5 mL PBS液中，渦旋混勻，分裝保存于-80 ℃備用。

1.3 主要試劑和材料 RNAiso Plus 試劑、Prime ScriptTMRT反轉錄試劑盒、rTaq DNA聚合酶、DNA Marker DL 2000、革蘭氏染色液、血瓊脂平皿，TSA瓊脂培養基和TSB肉湯培養基。

1.4 核酸提取 從臨床樣本中分別提取DNA 和RNA。使用RNAiso Plus 提取棉拭子總RNA，并按照Prime ScriptTMRT 試劑盒說明書合成cDNA，用酚-氯仿法提取棉拭子總DNA。cDNA和DNA均于－20 ℃保存備用。

1.5 病原的PCR檢測 采用文獻報道的方法對CPIV3、BVDV、BCoV、Pm、Mh、Mo、Mm Cluster 進行PCR 檢測，引物信息見表1。表1 引物送上海生工生物有限公司合成。

表1 引物信息

1.6 Pm 和Mh 的分離鑒定 對Pm 和Mh 的陽性樣本進一步作細菌分離鑒定。將5 份Pm、Mh 陽性鼻拭子樣本分別接種于含有10%小牛血清的TSB肉湯培養基中，在37 ℃搖床過夜培養16～24 h，增菌后接種于血瓊脂平板上，37 ℃培養16～24 h。觀察菌落的生長狀況，挑取疑似單個菌落在血瓊脂平板上純化3次，進行革蘭氏染色，鏡檢觀察細菌形態，并對純化后的細菌進行特異性PCR鑒定。

1.7 Mh 和Pm 的血清型鑒定 采用文獻報道的PCR方法對分離菌進行血清型鑒定，引物信息和來源見表2。引物均送上海生工生物有限公司合成。

表2 分型引物序列信息

2 結果

2.1 PCR 檢測結果 從5 份鼻拭子中均檢出了Mh 和Pm，未檢出其他病原。PCR 產物測序結果經Blast 比對，證實為Mh 和Pm 的目的片段（電泳圖見圖1和圖2）。

圖1 藏綿羊鼻拭子Mh的PCR檢測結果

圖2 藏綿羊鼻拭子Pm的PCR檢測結果

2.2 細菌的分離鑒定結果 從5 份鼻拭子中分離得到5 株Pm 和Mh。Pm 在血瓊脂培養基上培養24 h后，長出淡灰白色、露珠狀半透明菌落，菌落表面光滑、濕潤，無溶血環。鏡檢結果為革蘭氏陰性菌，菌體兩端鈍圓，呈細小的短桿狀或球桿狀。經特異性PCR鑒定，確定分離菌為Pm。

Mh 在血瓊脂培養基上培養18 h 長出露珠樣大小、圓形、光滑的灰白色菌落，并伴有草綠色的溶血環。革蘭氏染色后鏡檢可觀察到單個或散在排列的革蘭氏陰性短桿菌，兩端鈍圓。經特異性PCR鑒定，確定分離菌為Mh。

2.3 Pm、Mh血清型鑒定結果 血清型鑒定結果顯示，只有A2型引物從獲得的5株Mh 中擴增出目的片段（圖4），確定獲得的5 株Mh 均為A2 型Mh；Pm 的A、B、D、E、F 血清型引物擴增結果顯示，只有D 型引物從5 株Pm DNA 中擴增出目的條帶（圖5），確定分離到5株D型Pm。

圖4 Mh的血清型鑒定結果

圖5 Pm的血清型鑒定結果

3 討論

3.1 羊感染Mh 情況 Mh 是反芻動物重要的呼吸道致病菌之一，可引起新生羔羊發生急性肺炎，Mh 根據莢膜抗原進行血清分型，共有12 個莢膜血清型（1、2、5～9、12～14、16 和17 型），從羊中最常檢出1 型、2 型、6 型Mh［10］，國內羊群中最普遍的Mh 莢膜血清型是A2 型。目前尚無預防溶血性曼氏桿菌的相關疫苗，使用抗生素是治療本病的主要手段，近年來Mh 耐藥性的逐漸上升給Mh的治療增加了難度。

3.2 羊感染Pm 情況 Pm 根據其莢膜抗原可分為A型、B型、D型、E型和F型5個血清型［11］，我國羊群中以莢膜A型、B型、D型為主。近年來D 型多殺性巴氏桿菌在國內羊群中流行較多。不同Pm 莢膜血清型之間交叉免疫保護性低，目前還沒有針對D 型莢膜血清型Pm 的疫苗，有必要研制A、B、D型三價疫苗，為羊多殺性巴氏桿菌病的有效防控提供方便。

3.3 藏綿羊感染Mh、Pm 情況 不同羊群感染Pm 和Mh 的現象很普遍，但關于藏綿羊感染Mh、Pm的報道還很少。江金歡等［12］2017年從西藏山南市某地死亡的綿羊病料中分離出A2型溶血性曼氏桿菌；元振杰等［13］2018年從西藏日喀則市某發病羊場也分離到溶血性曼氏桿菌，且該分離株有很強的致病性；關于藏綿羊D型巴氏桿菌的報道僅有一篇［14］。

4 結論

結合臨床癥狀和細菌分離培養鑒定結果，確定該養殖場藏綿羊發生的呼吸道疾病是由多殺性巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌混合感染引起的。進一步分型結果顯示，Mh 為A2 型，Pm 為D型。■