siRNA沉默ECT2對人SW1990胰腺癌細胞中時鐘基因PER表達的影響

彭宇環 洪明昭 王洪 劉峰

(中國科學院大學深圳醫院 1藥學部，廣東 深圳；2內分泌科)

目前，糖尿病合并胰腺癌的患者增長顯著，其中以輕、中度中老年2型糖尿病患者為主，且男性多于女性〔1〕，糖尿病患者的胰腺癌發病率相比于正常人高出1.5～7.0倍。研究證實一些糖尿病患者的胰腺功能處于長期紊亂、胰島素抵抗狀態，慢性高血糖對胰腺腺泡細胞造成慢性刺激，最終導致胰腺癌〔2,3〕。除此以外，某些胰腺癌患者發現前就以糖尿病面孔出現，這是因為胰腺癌直接破壞胰島細胞，造成胰島素分泌減少，同時患者體內也容易產生胰島素抗體，最終引起血糖升高〔2,3〕。目前認為胰腺癌和糖尿病互為因果關系。但由于目前對其研究并不深入。因此，進一步探索其相關機制，探索其早期篩查標志物及相應的診療手段，有重要的理論價值和社會價值。有報道顯示上皮細胞轉化序列2癌基因(ECT2) mRNA及蛋白在胰腺癌組織中高表達，與患者生存相關〔4,5〕。本研究擬采用高糖培養基培養人SW1990胰腺癌細胞并采用siRNA-ECT2沉默ECT2表達，觀察其增殖能力和凋亡水平的改變，并采用熒光定量PCR檢測時鐘基因PER1和PER2表達水平，初步探討ECT2對人SW1990胰腺癌細胞中時鐘基因PER1和PER2的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 人SW1990胰腺癌細胞購自中國科學院細胞庫。主要試劑與儀器：化學合成siRNA-ECT2購自上海吉瑪生物公司；人SW1990胰腺癌細胞培養基購自美國ScienCell公司；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒及AV-PI細胞凋亡檢測試劑盒購自北京四正柏生物公司；熒光定量PCR試劑盒購自日本東洋紡公司。ST-360型酶標儀購自山東博科生物公司；FACSAria Ⅱ型流式細胞儀購自美國BD公司；9600型熒光定量PCR購自美國ABI公司。

1.2CCK-8法檢測SW1990細胞增殖能力 人SW1990胰腺癌細胞培養后，用培養基將其制成細胞懸液，然后采用細胞計數儀計數細胞，在96孔細胞培養板中每孔加入200 μl細胞懸液，即每孔1 000個細胞，將細胞培養板放置37℃二氧化碳細胞培養箱中培養24 h，設置對照組，再分別加入siRNA-ECT2,每個濃度設3個平行孔。分別培養24、48、72、96 h后在96孔細胞培養板的每個孔加入CCK-8 10 μl，然后繼續培養1 h后在酶標儀波長450 nm處讀取各孔吸光度(OD)值，以OD值表示細胞相對活力，繪制生長曲線。

1.3流式細胞術檢測SW1990細胞的凋亡水平 將SW1990細胞接種于6孔細胞培養板中，設置對照組，每組3個平行孔，參照說明書操作分別收集各組細胞，每管5×105個，1倍磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，用100 μl標記液重懸細胞，室溫下避光孵育15 min，每管樣本加入10 μl碘化丙啶(PI)，再加入預冷的1倍結合緩沖液后上機檢測。

1.4免疫印跡檢測相關蛋白表達 分別收集對照組、實驗組藥物作用48 h后的細胞提取總RNA，總RNA提取參照Trizol使用說明書進行。逆轉錄反應及熒光定量PCR參照TaKaRa公司說明書進行。PER1上游引物：TGCGCCCGCACTGCGATTTA，下游引物：TGGGATTTATTACTGCAGGGGGACA，擴增產物長度75 bp；PER2上游引物：TGCGCCCGCACTGCGATTTA，下游引物：TGGGATTTATTACTGCAGGGGGACA，擴增產物長度106 bp；β-actin上游引物：CTCCATCCTGGCCTCGCTGT，下游引物：GCTGTCACCTTCACCGTTCC，擴增產物長度268 bp。采用2-ΔΔCt分析法計算目的基因相對表達量。

1.5統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析及LSD法檢驗。

2 結 果

2.1siRNA-ECT2對SW1990胰腺癌細胞活力的影響 24、48、72、96 h檢測OD值，各濃度作用組的細胞OD顯著下降，與對照組相比較有顯著差異(P<0.05)。CCK-8實驗結果表明siRNA-ECT2可以抑制人SW1990胰腺癌細胞的增殖，呈現一定劑量性和時效性。見表1。

表1 siRNA-ECT2對SW1990胰腺癌細胞活力的影響

2.2siRNA-ECT2促進SW1990胰腺癌細胞發生凋亡 siRNA-ECT2干預高糖培養的胰腺癌細胞后，SW1990細胞的凋亡率上調，對照組(2.57%±0.21%)與siRNA-ECT2組相比(21.44%±0.78%)差異顯著(P<0.05)。見圖1。

2.3siRNA-ECT2上調SW1990細胞中PER1和PER2基因表達 siRNA-ECT2組PER1和PER2 mRNA相對表達量(3.899 8±0.139 0、4.340 2±0.294 1)，明顯高于對照組(1.031 5±0.030 2、1.212 1±0.107 8，均P<0.05)。

圖1 siRNA-ECT2對SW1990胰腺癌細胞的促凋亡作用

3 討 論

胰腺癌因為惡性程度高、預后差，被稱為癌癥之王〔6〕。胰腺癌常見的分為兩種病理類型，包括胰腺導管腺癌(約占90%)和胰腺內分泌腫瘤(少于5%)〔7〕。目前針對胰腺癌的治療方案主要包括手術治療、傳統放化療、新輔助治療及免疫療法，但仍未能顯著提高患者的生存率，且5年生存率極低，迫切需要有效的新治療方式〔8～10〕。糖尿病患者由于糖代謝異常，高糖長期對于胰島細胞的損傷，誘發胰腺癌的概率大大升高，糖尿病合并胰腺癌并不罕見，出現這種合并癥狀患者在治療方案也與單純胰腺癌患者方案有所調整〔2,3,11,12〕。代謝調控是生物信號輸出的重要途徑，如糖代謝紊亂容易誘發肥胖或糖尿病，而時鐘基因在這其中發揮重要作用。外周生物鐘在人體大部分組織中廣泛存在，外周生物鐘并不能自主產生生理節律，而是由位于大腦中的視交叉上核控制下的神經、體液等其他信號分子進行調控〔13～15〕。目前已明確有一些不良的生活習慣可以影響生物鐘基因的震蕩表達模式，從而進一步影響生物鐘的變化，包括糖尿病在內的各種疾病〔16,17〕。有報道顯示在糖尿病患者外周血白細胞中PER1及PER3的表達顯著降低，提示糖尿病患者生理節律的紊亂〔18,19〕。我國是全球糖尿病患者最多的國家。糖尿病發病的關鍵環節是胰島β細胞的功能受到損害及胰島素抵抗。通過小鼠實驗發現，當小鼠胰島β細胞中的生物鐘基因發生異常變化時，胰島素的分泌會發生障礙，同時葡萄糖代謝發生紊亂，并進一步促進糖尿病的發生〔20,21〕。因此從生物鐘的角度為切入點，尋找預防與治療糖尿病的新靶點與新方法打開了新的思路。

ECT2位于人類腫瘤較易發生突變的染色體3Q26區域，在多種腫瘤組織中表達，屬于Rho家族特異性交換因子，在DNA損傷應答和細胞周期調控中發揮重要作用，并可通過調節Rho調控胞質分裂過程。此外ECT2可引起RAS同源(RHO)家族小GTP酶的異常激活，與腫瘤及多種疾病密切相關。ECT2在非小細胞肺癌、惡性結腸癌、胰腺癌等組織中高表達，且可以促進腫瘤增殖、侵襲及轉移〔22〕。

本研究結果顯示采用siRNA沉默ECT2的表達能夠抑制胰腺癌細胞生長，且能夠促進胰腺癌細胞發生凋亡，另外，提示ECT2有可能參與調控相應基因從而改變PER1和PER2的表達，有可能對于生理節律相關基因有一定調控，對于糖尿病合并胰腺癌患者臨床上調節生理節律，有助于其治療和生存狀態的改善。