老年子宮內膜癌患者組織中環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3表達及意義

梁秀蘭 邱紅兵 鄭玉丹

(邢臺市人民醫(yī)院婦三科第三病區(qū)，河北 邢臺 054000)

70%～75%的子宮內膜癌發(fā)生于絕經(jīng)后女性，高發(fā)年齡為70～79歲〔1〕。臨床研究認為年齡是子宮內膜癌預后的獨立影響因素，高齡子宮內膜癌患者預后差〔2〕；老年子宮內膜癌患者與中年患者相比，在組織浸潤、病理類型、相關標志物水平、腫瘤復發(fā)率等方面存在一定差異〔3〕。目前子宮內膜癌的發(fā)病機制仍未完全明確，其發(fā)生與進展涉及血管生成、細胞增殖與凋亡、免疫炎癥反應等多個方面，受多種因素影響〔4〕。近年來隨著分子生物技術的快速發(fā)展，基因檢測逐漸用于惡性腫瘤的診斷、病情評估、預測預后水平，具有較高的臨床參考價值〔5〕。本研究旨在探討老年子宮內膜癌患者組織中環(huán)氧合酶2、核轉錄因子(NF)-κB、轉錄活化因子(STAT)3表達特點及對病情發(fā)展和預后的影響。

1 資料與方法

1.1病例資料 選取2015年1～12月邢臺市人民醫(yī)院收治的老年子宮內膜癌患者160例。入選標準：①年齡≥60歲，住院手術治療或在門診行病理活檢；②組織病理學檢查確診為子宮內膜癌；③能夠正常溝通，完成隨訪，研究資料完整。排除標準：①合并其他類型惡性腫瘤；②采集標本前有放化療、激素治療史者。年齡60～79歲，平均(71.83±4.59)歲。收集同期在本院因子宮良性腫瘤切除子宮的老年患者80例，年齡60～77歲，平均(71.17±5.20)歲。年齡在子宮內膜癌與子宮良性腫瘤患者間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2主要試劑與儀器 兔抗人環(huán)氧合酶2單克隆抗體、鼠抗人NF-κB單克隆抗體、鼠抗人STAT3單克隆抗體購于北京博奧森生物有限公司；PV9000二步法免疫組化檢測試劑盒購于上海齊一生物有限公司；總RNA提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司。LS-2065石蠟切片機購于深圳達科為生物股份有限公司；IX73倒置顯微鏡購于日本奧林巴斯株式會社。

1.3免疫組化檢測環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3陽性表達情況 使用10%多聚甲醛固定子宮內膜癌組織和正常子宮內膜組織標本，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。PV9000二步法行免疫組化檢測，加入兔抗人環(huán)氧合酶2單克隆抗體(1∶500稀釋)、鼠抗人NF-κB單克隆抗體(1∶800稀釋)、鼠抗人STAT3單克隆抗體(1∶800稀釋)，操作嚴格按試劑盒說明書進行。光學顯微鏡高倍鏡下隨機選取6個視野拍照，進行陽性細胞計數(shù)。根據(jù)染色細胞數(shù)量和染色強度評分進行評價；染色細胞數(shù)量評分：陽性細胞比例<25%計1分、25%～50%計2分、51%～75%計3分、>75%計4分；染色強度評分：無染色計0分、淺黃色計1分、黃色計2分、棕黃色計3分；二者乘積≤2分為陰性，≥3分為陽性。

1.4RT-PCR檢測環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3 mRNA表達 總RNA提取試劑盒收集子宮內膜癌組織和正常子宮內膜組織的總RNA，逆轉錄得到cDNA。PCR擴增引物由上海達為科生物有限公司設計合成。引物序列為環(huán)氧合酶2上游：5′-GAAGTCCCCTCTTTAACCGAG-3′，下游：5′-CTTTAGACGGGT-CGTGATGCCA-3′。NF-κB上游：5′-ACGTCATTAGGCGGTCGGAA-3′，下游：5′-CTCATGTAGTAGGTC-GTCGTG-3′。STAT3上游：5′-GCAACGTAGGCTG-GAGTGGA-3′，下游：5′-AGTCTCGTTACGTAGGAC-GTT-3′。β-actin上游：5′-GGTAGTGTTACGGACACCATGCTG-3′，下游引物：5′-G GTGGTACATGGGTCCGTAACG-3′。反應體系20 μl，擴增條件：95℃預變性1 min，95℃變性1 min，50℃復性50 s，共40個循環(huán)，72℃延伸2 min。以參照基因β-actin為標準進行相對定量。

1.5Western印跡檢測環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3 mRNA蛋白表達 放射免疫沉淀(RIPA)裂解液提取子宮內膜癌組織和正常子宮內膜組織的總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將目標蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，使用脫脂奶粉封閉液室溫下封閉1 h，滴加兔抗人環(huán)氧合酶2單克隆抗體(1∶500稀釋)、鼠抗人NF-κB單克隆抗體(1∶800稀釋)、鼠抗人STAT3單克隆抗體(1∶800稀釋)、鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4℃孵培育過夜。滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，1∶2 000稀釋，室溫靜置1 h，電化學發(fā)光(ECL)顯影，使用Image J軟件讀取各條帶的灰度值。

1.6隨訪及資料收集 對子宮內膜癌患者進行為期5年的隨訪，采取電話結合定期門診復查的形式，記錄生存情況。入組時收集子宮內膜癌患者的分化程度、國際婦產科聯(lián)合會(FIGO)分期、淋巴結轉移情況、肌層浸潤情況。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗及單因素和多因素Cox回歸分析。

2 結 果

2.1不同組織中環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3表達情況 環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3蛋白主要表達于細胞質、細胞核中，陽性表達呈黃色或棕黃色顆粒。子宮內膜癌組織中環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3陽性表達率明顯高于正常子宮內膜組織(均P<0.001)。見圖1，表1。

2.2不同組織中環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3 mRNA和蛋白表達水平比較 子宮內膜癌組織中環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3 mRNA和蛋白表達水平明顯高于正常子宮內膜組織(均P<0.001)。見表2。

圖1 不同組織中環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3蛋白表達(免疫組化染色，×200)

表1 不同組織中環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3陽性表達水平比較〔n(%)〕

2.3老年子宮內膜癌患者環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3表達與臨床病理參數(shù)的關系 環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3表達水平在不同分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移、肌層浸潤的老年子宮內膜癌患者之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；其中中低分化、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、肌層浸潤≥1/2的環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3表達水平明顯偏高。見表3。

2.4不同環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3表達情況患者生存時間比較 環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3陽性表達者生存時間〔(26.84±4.97)、(28.05±4.36)、(25.69±5.24)個月〕短于陰性表達者〔(47.52±3.04)、(48.81±3.59)、(50.37±2.71)個月〕，差異有統(tǒng)計學意義(t=25.189、27.053、30.697，均P=0.000)。

2.5老年子宮內膜癌患者預后影響因素的單因素分析 單因素Cox回歸分析顯示，分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移、肌層浸潤、環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3是老年子宮內膜癌患者預后的影響因素(P<0.05)。見表4。

表2 不同組織中環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3 mRNA和蛋白表達水平比較

表3 老年子宮內膜癌患者環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3表達與臨床病理參數(shù)的關系〔n(%)〕

表4 老年子宮內膜癌患者預后影響因素的單因素分析

2.6老年子宮內膜癌患者預后的多因素Cox回歸分析 將單因素分析中分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移、肌層浸潤、環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3進一步納入多因素Cox回歸分析模型，結果顯示，F(xiàn)IGO分期、淋巴結轉移、肌層浸潤、環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3是老年子宮內膜癌患者預后的獨立影響因素(P<0.05)。見表5。

表5 老年子宮內膜癌患者預后的Cox多因素分析

3 討 論

環(huán)氧合酶2是前列腺合成中的關鍵酶，可通過調節(jié)前列腺素的合成來影響機體的病理生理過程〔6〕。環(huán)氧合酶2基因屬于誘導表達蛋白，正常生理狀態(tài)下人體組織細胞中低表達或不表達，當受到刺激后出現(xiàn)誘導性表達〔7〕。本研究結果提示環(huán)氧合酶2參與子宮內膜癌的發(fā)生與發(fā)展，其過表達促進腫瘤發(fā)展的可能原因為，促進腫瘤細胞增殖、遷移和轉移，抑制細胞凋亡，誘發(fā)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制并刺激新生血管形成〔8〕。NF-κB是人體細胞中的重要轉錄因子，介導機體免疫、應激反應、細胞凋亡、細胞增殖等過程，具有多種功能〔9〕。相關研究顯示，NF-κB能夠誘發(fā)腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉移等過程，在肝細胞癌、肺癌等多種惡性腫瘤組織中均存在NF-κB持續(xù)激活〔10，11〕。目前研究認為NF-κB引發(fā)腫瘤的機制包括：①通過對細胞周期素D1的調控來誘發(fā)細胞不受控制的無限增殖〔12〕；②通過激活凋亡抑制基因，合成抗凋亡因子，激活原癌基因等機制來抑制細胞凋亡信號傳導，減慢細胞凋亡速率〔13〕。本研究結果提示NF-κB參與子宮內膜癌的發(fā)生與進展，在其中發(fā)揮重要作用。

STAT3是近年來被廣泛研究的轉錄因子，參與機體正常細胞的增殖、分化和新生血管生成和調控免疫活動〔14〕。當STAT3異常活化后能夠介導細胞增殖、轉移、侵襲和凋亡等過程，在腫瘤新生血管形成、免疫逃逸等過程中發(fā)揮重要作用〔15〕。相關研究顯示，膠質瘤組織中STAT3表達水平明顯高于正常腦組織，其在高級別腦膠質瘤組織中的表達水平明顯高于低級別膠質瘤組織〔16〕。本研究結果提示STAT3能夠作為一項反映子宮內膜癌生物學行為的重要指標，用于臨床診斷和預后評估。對子宮內膜癌患者進行為期5年的隨訪，結果顯示，環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3可作為預測患者預后的參考指標。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤淋巴結轉移和侵襲性與子宮內膜癌患者術后生存時間明顯相關〔17〕，本研究中FIGO分期、淋巴結轉移、肌層浸潤能夠間接反映出子宮內膜癌轉移和侵襲能力，影響患者生存時間。

綜上，環(huán)氧合酶2、NF-κB、STAT3陽性的子宮內膜癌患者生存時間較短，可能與腫瘤分化程度較低、分期較高、肌層浸潤程度高、淋巴結轉移比例高有關，可作為子宮內膜癌患者腫瘤侵襲性和預后評估的參考指標。