桑葉總黃酮經(jīng)自噬途徑抑制NLRP3 炎癥小體對糖尿病心肌病大鼠心肌的影響

楊衛(wèi)杰 曹晶晶

(河南醫(yī)學高等專科學校，河南 新鄭 451191)

糖尿病心肌病(DCM)為糖尿病患者嚴重的并發(fā)癥，代謝紊亂、氧化應(yīng)激、微循環(huán)障礙、炎癥反應(yīng)、自噬作用均參與了該病的發(fā)病過程〔1〕。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(NLRP)3炎癥小體作為炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，對DCM的發(fā)生具有一定的促進作用，而細胞自噬在部分相關(guān)疾病中對NLRP3炎癥小體的激活具有一定的負向調(diào)控作用〔2〕。桑葉總黃酮(MLF)是從中草藥桑干燥葉中提取的有效成分，具有降低血糖水平和改善胰島素敏感性等多種治療作用，并對腎間質(zhì)纖維化具有一定的防治作用〔3〕，但其對心肌病的作用的研究報道較少。本研究探討MLF對DCM大鼠的心肌細胞的影響，并進一步探討其對細胞自噬和NLRP3炎癥小體的影響并分析其機制。

1 材料與方法

1.1藥物與動物 桑葉飲片(批號：20180924)購自四川省中藥飲片有限責任公司。依據(jù)預(yù)實驗，選擇70%乙醇按照1∶20的料液浸泡12 h，70℃、540 W條件下，采用超聲波提取儀提取3次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮得濃縮液。濃縮液上AB-8大孔樹脂，選擇75%乙醇洗脫液，減壓濃縮，真空冷凍干燥得MLF粉末。亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測得總黃酮質(zhì)量分數(shù)為88.4%。SPF級雄性SD大鼠，體重(190±10)g，購自河南省實驗動物中心，許可證號：SYXK(豫)2016-0002。

1.2試劑與儀器 二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準字H20023370)；鏈脲佐菌素(上海懋康生物科技有限公司，批號180114)；肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物研究所，批號20180312、20180129)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，批號P0012S)；自噬效應(yīng)蛋白(Beclin)-1(編號AF5123)、自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈(LC)3 Ⅱ(編號AF5225)抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗NLRP3(批號ab232401)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-1(批號ab179515)、凋亡相關(guān)微粒蛋白(ASC，批號ab47092)及二抗IgG(羊抗兔，批號ab150077)購自美國Abcam公司。白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒(南京建成生物研究所，批號20180312、20180226)。AL104 型電子天平(瑞士梅特勒托利多儀器公司)；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；UV-2501PC 型紫外分光光度計(日本島津公司)。

1.3模型建立 50只大鼠給予高脂飼料(10%精制豬油，20%蔗糖，8%蛋奶精粉，2%膽固醇和60%正常食物)喂養(yǎng)，持續(xù)8 w。動物腹腔內(nèi)注射35 mg/kg的鏈脲佐菌素(溶于檸檬酸鹽緩沖液(pH4.5)，另取10只注射同體積的檸檬酸鹽緩沖液作為對照。72 h及7 d后檢測空腹血糖水平>16.7 mmol/L則糖尿病模型建模成功。

1.4分組與給藥 建模成功的50只大鼠隨機分成模型組、陽性對照組(二甲雙胍140 mg/kg)、MLF低劑量組(50 mg/kg)、MLF中劑量組(100 mg/kg)、MLF高劑量組(200 mg/kg)，而普通喂養(yǎng)且未造模的10只大鼠為對照組。建模成功后，大鼠每天按照設(shè)定劑量灌胃給藥，MLF均以5%羧甲基纖維素鈉混懸，對照組和模型組均給予對應(yīng)體積的5%羧甲基纖維素鈉，連續(xù)6 w。給藥期間，模型組、給藥組給予高脂飼料喂養(yǎng)，對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.5心功能指標檢測 大鼠給藥后禁食12 h，水合氯醛(10 mg/ml)麻醉大鼠，小動物超聲成像系統(tǒng)(Vivid 7，GE Medical，美國)經(jīng)胸檢查，記錄左室射血分數(shù)(LVEF)、舒張早期二尖瓣血流速度與舒張晚期二尖瓣血流速度比值(E/A)、左室等容舒張時間(IVRT)。

1.6標本采集 超聲檢查結(jié)束后，稱重、麻醉、固定、胸腔打開，左心室取血3 ml，3 000 r/min 8 min，得血清，-80℃冰箱保存。剝離心臟，吸干表面水分，取左心室1/2置于液氮罐內(nèi)備存。

1.7血清中CK、LDH水平檢測 取血清，采用微板法檢測LDH活性，比色法檢測CK活性，檢測過程嚴格按照說明書過程要求操作進行。

1.8心肌組織內(nèi)自噬水平檢測 Western印跡檢測心肌組織中Beclin-1、LC3 Ⅱ水平，取凍存的心肌組織，研磨，加細胞裂解液，冰上勻漿、裂解，14 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA比色測定法估算裂解液的蛋白質(zhì)含量。將裂解液樣品置于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上，然后將其轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶封閉2 h，將PVDF膜與抗Beclin-1、LC3 Ⅱ的一抗(1∶2 000、1∶2 000)在4℃孵育過夜。將膜與辣根過氧化物酶(HRP，1∶1 000)耦聯(lián)的二抗孵育50 min。凝膠成像系統(tǒng)分析各條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參分析各蛋白條帶的相對表達水平。

1.9心肌組織中IL-1β、TNF-α水平表達 稱取心肌組織100 mg，加入生理鹽水冰浴勻漿，4℃ 14 000 r/min離心10 min，取上清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定IL-1β、TNF-α水平。檢測過程嚴格按照說明書過程要求操作進行。

1.10心肌組織NLRP3炎癥小體激活情況檢測 Western印跡檢測心肌組織中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白水平，方法參照1.8。

1.11統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組心功能指標比較 與模型組比較，對照組LVEF、E/A、IVRT水平均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組及MLF各劑量組LVEF、E/A、IVRT水平均明顯增加，MLF低劑量組0.05)。見表1。

表1 各組心功能指標比較

2.2各組血清中CK、LDH水平比較 與模型組比較，對照組CK、LDH水平均明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組和MLF各劑量組CK、LDH水平均明顯降低，且MLF低劑量組>MLF中劑量組>MLF高劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)；與陽性對照組比較，MLF低、中劑量組CK、LDH水平明顯增加(P<0.01)，MLF高劑量組CK水平明顯增加(P<0.05)，而LDH水平無顯著差異(P>0.05)。見表2。

2.3各組心肌組織內(nèi)自噬水平比較 與模型組比較，對照組Beclin-1、LC3 Ⅱ水平均明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組及MLF各劑量組Beclin-1、LC3 Ⅱ水平均明顯增加，且MLF低劑量組0.05)。見圖1、表2。

1～6:對照組、模型組、陽性對照組、MLF低劑量組、MLF中劑量組、MLF高劑量組；圖2同圖1 各組心肌組織內(nèi)自噬水平比較

2.4各組心肌組織中IL-1β、TNF-α水平比較 與模型組比較，對照組IL-1β、TNF-α水平均明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組與MLF組各劑量IL-1β、TNF-α水平均明顯降低，且MLF低劑量組>MLF中劑量組>MLF高劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)；與陽性對照組比較，MLF低、中劑量組IL-1β、TNF-α水平明顯增加(P<0.01)，MLF高劑量組各指標無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組血清中CK、LDH水平及心肌組織內(nèi)自噬水平和IL-1β、TNF-α水平比較

2.5各組心肌組織NLRP3炎癥小體激活情況 與模型組比較，對照組NLRP3、ASC、Caspase-1水平均明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組與MLF各劑量組NLRP3、ASC、Caspase-1水平均明顯降低，且MLF低劑量組>MLF中劑量組>MLF高劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與陽性對照組比較，MLF低、中劑量組NLRP3、ASC、Caspase-1水平明顯增加(P<0.01)，MLF高劑量組各指標無顯著差異(P>0.05)。見表3、圖2。

表3 各組心肌組織NLRP3 炎癥小體激活情況比較

圖2 各組心肌組織NLRP3 炎癥小體激活情況

3 討 論

以往的研究主要集中在桑葉中提取的總黃酮的降血糖作用〔4〕及其可預(yù)防胰島損傷〔5〕，但其對心肌病作用的研究較少。本研究結(jié)果說明MLF能有限改善心臟功能，保護心肌損傷，減少心肌重構(gòu)。

研究顯示，DCM中促炎性細胞因子(IL-1β，TNF-α)的釋放增加，促進了DCM的發(fā)展。因此，減少炎癥是阻礙DCM發(fā)展的有效策略〔6〕。研究顯示，NLRP3炎性小體由NLRP3受體和凋亡相關(guān)斑點樣蛋白組成，其中包含ASC和Caspase-1前體。NLRP3受體的激活刺激了NLRP3炎性體，將前體Caspase-1轉(zhuǎn)化為裂解的Caspase-1〔7〕。在此基礎(chǔ)上，通過剪切IL-1β前體，激活其成熟和分泌，從而發(fā)揮生物學作用。活化的NLRP3炎性體產(chǎn)生大量炎癥細胞因子，如IL-1β和TNF-α，它們在各種慢性疾病中發(fā)揮作用，包括糖尿病。在糖尿病相關(guān)研究中，鏈脲佐菌素注射會增加NLRP3誘導的炎癥，因此NLRP3炎性小體抑制可改善DCM模型的心臟功能障礙〔8〕。本研究結(jié)果說明MLF抑制 NLRP3 炎癥小體介導的炎癥反應(yīng)是其發(fā)揮對心臟保護作用的重要機制，同時也說明抑制心臟炎癥可能是一種治療DCM的策略。

自噬作為一種細胞內(nèi)的分解代謝過程，可在不利的環(huán)境條件下(如氧化應(yīng)激和高血糖癥)維持細胞穩(wěn)態(tài)。最近的研究表明，自噬在1型和2型糖尿病動物模型的心臟中受到抑制，這表明自噬的抑制可能促進DCM的進展〔9〕。自噬通過直接消除活性炎癥小體和間接去除如活性氧(ROS)、細胞內(nèi)病原微生物或受損細胞器等炎癥刺激物來減輕炎癥〔10〕。本研究結(jié)果說明MLF能誘導心肌細胞發(fā)生自噬作用。研究顯示，自噬對NLRP3炎性小體的激活具有一定的調(diào)節(jié)作用，二者相互影響，表現(xiàn)為自噬對NLRP3炎性小體具有負性調(diào)控作用。研究顯示，在自噬誘導的模型中，NLRP3炎性小體受到有效的抑制，IL-1β水平明顯降低。而細胞自噬還可通過自我消化過程，將NLRP3炎性小體組分隔離開來，抑制NLRP3炎性小體的活化和進展〔11〕。結(jié)合本研究結(jié)果分析顯示，MLF對NLRP3炎性小體組分活化的抑制作用，可能與其誘導心肌細胞自噬有關(guān)。

綜上，MLF能有效地抑制心肌細胞NLRP3 炎癥小體組分的活化，并達到對DCM進展的抑制作用，其機制可能與誘導心肌細胞自噬有關(guān)。