miR-134/CREB/BDNF通路在低頻重復經顱磁刺激影響癲癇大鼠抑郁、焦慮樣行為中的作用

宋晉 梁婷 王強 陳繪景

(1武漢科技大學醫學院，湖北 武漢 430065；2武漢市精神衛生中心)

癲癇是一種慢性大腦短暫性功能障礙，患者反復發作會出現抑郁、焦慮等精神問題，嚴重影響患者身心健康及生活質量〔1,2〕。目前癲癇治療仍以藥物為主，但仍有20%～30%癲癇患者經藥物治療無效，因此探索安全、無創的有效抗癲癇手段至關重要。低頻重復經顱磁刺激(rTMS)是一種新型無痛、無創性抗癲癇技術，可降低癲癇患者發作頻率、減輕抑郁樣行為〔3～5〕，但其具體作用機制尚不完全明確。研究發現，異常突出形成可能與癲癇發生發展有關，位于突觸后成分中的樹突棘形成和降解動態變化是突觸可塑性的標志，而微小RNA(miR)-134與樹突棘的發育有關，對神經可塑性起重要作用，可參與癲癇及腦神經疾病的發生發展〔6,7〕。環腺苷酸應答元件結合蛋白(CREB)是神經可塑性重要調節因子，腦源性神經營養因子(BDNF)是CREB經典下游靶基因，對多種神經元具有營養、成熟等作用，可促進神經元的可塑性及神經遞質的形成，與抑郁、焦慮樣行為及認知障礙等密切相關〔8～10〕，但關于rTMS抗癲癇作用是否與調節miR-134/CREB/BDNF通路有關鮮有研究。本研究擬探究rTMS對癲癇大鼠抑郁、焦慮樣行為及miR-134/CREB/BDNF通路的影響，以期揭示其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康成年雄性清潔級SD大鼠36只，體重280～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。于本院實驗動物房環境溫度(23±2)℃、濕度(60±5)%，12 h晝夜節律控制條件下飼養，自由飲水、采食。

1.2主要試劑及儀器 氯化鋰(貨號：L4408，純度≥99.0%)購自Sigma-Aldrich公司；硫酸阿托品(國藥準字H20073819)購自河南普瑞制藥有限公司；毛果蕓香堿(貨號：92-13-7)購自湖北諾納科技有限公司；Trizol試劑(貨號：R0016)、蛋白抽提試劑盒(貨號：P0028)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(貨號：P0010S)均購自上海碧云天公司；miR定量試劑盒(貨號：638315)、PrimeScriptTMRT reagent Kit(貨號：RR037A)、TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ(貨號：RR820A)均購自TaKaRa公司；引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成；兔源一抗anti-CREB(貨號：ab31387)、anti-p-CREB(貨號：ab220798)、anti-BDNF(貨號：ab108319)、anti-β-actin(貨號：ab-179467)、二抗羊抗兔IgG(貨號：ab6721)均購自英國Abcam公司；Evolution 220紫外分光光度計、MODEL550型酶標儀均購自美國Thermo公司；7500熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)儀購自美國Bio-Rad公司等。

1.3方法

1.3.1分組及癲癇大鼠模型制備 36只大鼠隨機分為正常對照組(NC組)、假刺激組(s-rTMS組)及rTMS組，每組12只。NC組為正常飼養未進行任何刺激正常大鼠；rTMS組大鼠行rTMS刺激，刺激參數：0.75 Hz，75%閾強度，20次/串，5串/d；s-rTMS組給予次數相同、聲音相似的假性刺激，均連續7 d。7 d后s-rTMS組及rTMS組腹腔注射氯化鋰127 mg/kg，16～20 h后注射毛果蕓香堿35 mg/kg，注射毛果蕓香堿前30 min注射阿托品1 mg/kg，根據Racine分級〔11〕(0級：無任何反應；Ⅰ級：面部陣攣，包括眨眼、動須、節奏性咀嚼等；Ⅱ級：Ⅰ級反應+節律性點頭；Ⅲ級：Ⅱ級反應+前肢陣攣；Ⅳ級：Ⅲ級反應+后肢站立；Ⅴ級：Ⅳ級反應+摔倒)觀察大鼠癲癇發作程度，連續3次達到Ⅳ～Ⅴ級發作即被認為癲癇持續狀態(SE)即造模成功，SE點燃1 h后腹腔注射地西泮10 mg/kg終止發作。NC組大鼠腹腔注射等量生理鹽水代替毛果蕓香堿，其余處理同s-rTMS組及rTMS組。

1.3.2抑郁樣行為學檢測 采用強迫游泳實驗及曠場實驗檢測大鼠抑郁樣行為。(1)強迫游泳實驗：準備圓柱形透明玻璃容器，直徑20 cm，高50 cm，水溫23～25 ℃，水深35 cm，使得大鼠在其中不能靠四肢或尾巴支撐桶底而把頭露出水面呼吸。實驗前1 d進行15 min適應性訓練。實驗時將大鼠置于容器內，記錄其在5 min內累積不動時間，其中“不動”標準為：漂浮在水中不掙扎或僅保持頭部在水面以上或接觸水池底部超過1 s。(2)曠場實驗：將大鼠放入80 cm×80 cm×40 cm的黑色敞箱中，箱底均勻劃分5 cm×5 cm小格，每次從同一方向放入，記錄大鼠5 min內水平站立次數及垂直站立次數。

1.3.3焦慮樣行為學檢測 分別采用高架十字迷宮實驗及新穎環境抑制攝食測試檢測大鼠焦慮樣行為。(1)高架十字迷宮實驗：將大鼠置于標準高架迷宮正中央，頭超封閉壁，使大鼠自由探索5 min，記錄大鼠進入開放臂次數(OE)、封閉臂次數(CE)及封閉臂停留時間(CT)、開放臂停留時間(OT)，計算總穿臂次數(TE)：OE+CE；進入開放臂次數的比例(OE%)：OE/(OE+CE)× 100%；開放臂停留時間比例(OT%)：OT/(OT+CT)×100%。(2)新穎環境抑制攝食測試：利用大鼠喜歡趨邊特性，檢測焦慮樣行為。大鼠禁食24 h后，保持實驗環境安靜，然后將大鼠放入頂部開放、底部劃分為大小均勻的15 cm× 15 cm方格木質箱子的角落，中間擺放一顆食物，攝像頭記錄10 min內大鼠從放進盒子里到準備進食的攝食潛伏期，以此作為評價焦慮樣行為的指標。

1.3.4海馬miR-134、CREB及BDNF mRNA相對表達量檢測 各組大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛1 ml/kg麻醉處死后斷頭取腦，分離海馬組織。采用Trizol試劑提取總RNA，濃度和純度檢測合格后反轉錄得到cDNA，置于-80℃中保存備用。采用RT-qPCR擴增miR-134、CREB及BDNF mRNA片段。引物序列：miR-134：上游：5′-GGGTGTGACTGGTTGAC-3′，下游：5′-CACAGCTCGTAGAACAGGAGG-3′；U6：上游：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；CREB：上游：5′-CCACTCAGCCGGGTACTACC-3′，下游：5′-CACCAGAGGCAGCTTGAACA-3′；BDNF：上游：5′-GCTGCTGGATGAGGACCAGA-3′，下游：5′-CCAAAA-GGCACTTGACTGCTG-3′;GAPDH：上游：5′-GTCG-ATGGCTAGTCGTAGCATCGAT-3′，下游：5′-TGCTA-GCTGGCATGCCCGATCGATC-3。RT-qPCR采用20 μl反應體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×)0.4 μl，cDNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，ddH2O 6.0 μl。反應條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法分析miR-134、CREB及BDNF mRNA相對表達量。

1.3.5海馬CREB、p-CREB、BDNF蛋白表達量檢測 Western印跡檢測各組大鼠海馬CREB、p-CREB、BDNF蛋白表達情況。采用蛋白抽提試劑盒提取海馬總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，置于-80℃保存備用。取50 mg蛋白樣品，80 mV電壓下6%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)2 h，250 mA下聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉膜70 min。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入適量含2%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，加一抗anti-CREB(1∶1 000)、anti-p-CREB(1∶1 000)、anti-BDNF(1∶5 000)、anti-β-actin(1∶5 000)4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，每次20 min，添加二抗IgG(1∶5 000)37℃孵育1.5 h，顯色，曝片，觀察并分析各蛋白條帶灰度值。

1.4統計學方法 采用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1rTMS對癲癇大鼠抑郁樣行為的影響 與NC組比較，s-rTMS組不動時間顯著延長，水平站立次數及垂直站立次數顯著減少(P<0.05)；與s-rTMS組比較，rTMS組不動時間顯著縮短，水平站立次數及垂直站立次數顯著增加(P<0.05)，見表1。

2.2rTMS對癲癇大鼠焦慮樣行為的影響 與NC組比較，s-rTMS組TE、OE%、OT%顯著減少，攝食潛伏期顯著延長(P<0.05)；與s-rTMS組比較，rTMS組TE、OE%、OT%顯著增加，攝食潛伏期顯著縮短(P<0.05)，見表1。

表1 各組抑郁樣、焦慮樣行為比較

2.3rTMS對癲癇大鼠海馬miR-134、CREB及BDNF mRNA相對表達量的影響 與NC組比較，s-rTMS組miR-134相對表達量顯著降低，CREB及BDNF mRNA相對表達量顯著增加(P<0.05)；與s-rTMS組比較，rTMS組miR-134相對表達量顯著增加，CREB及BDNF mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.4rTMS對癲癇大鼠海馬CREB、p-CREB及BDNF蛋白表達量的影響 與NC組比較，s-rTMS組p-CREB/CREB及BDNF蛋白表達量顯著增加(P<0.05)；與s-rTMS組比較，rTMS組p-CREB/CREB及BDNF蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，見圖1、表3。

表2 各組海馬miR-134、CREB及BDNF mRNA相對表達量比較

圖1 Western印跡檢測海馬CREB、p-CREB及BDNF蛋白表達

表3 各組海馬p-CREB/CREB及BDNF蛋白表達量比較

3 討 論

癲癇反復發作可導致神經元壞死和凋亡、特異性突觸重塑、苔蘚纖維出牙等，進而可促進異常興奮性環路形成，發展為難治性癲癇〔12〕。近來rTMS成為抗癲癇的潛在治療手段，但文獻報道中rTMS治療癲癇的刺激參數各不相同，rTMS調節皮質興奮性效應與刺激頻率有關，通常高頻(>1 Hz)可增強皮質興奮性，而低頻(≤1 Hz)可抑制皮質興奮性〔13,14〕，Li等〔15〕研究報道，長期間歇性低頻率rTMS可有效控制不服藥青少年癲癇患者的癲癇發作。Wang等〔16〕研究報道，低頻rTMS治療可改善癲癇大鼠抑郁、焦慮狀態，但不能減輕其癲癇發作程度。而有研究報道對右頂葉皮層的1 Hz rTMS會干擾短暫出現刺激的感知〔17〕。本研究結果提示癲癇大鼠出現抑郁、焦慮樣行為，模型制備成功，可用于后續試驗；提示rTMS可顯著改善癲癇大鼠抑郁及焦慮樣行為，有一定臨床應用價值，但對癲癇伴抑郁、焦慮樣行為障礙的影響及作用機制尚無明確定論。

miR-134是一種廣泛分布于腦內海馬特殊小RNA，可調節神經元的微觀結構及樹突棘大小，與癲癇等神經系統疾病密切相關。王倩等〔18〕研究報道，難治性癲癇患者顳葉皮質及癲癇動物海馬中miR-134表達下降，CREB、p-CREB表達升高。Zhu等〔19〕研究報道，癲癇病大鼠海馬miR-134水平在3 d后明顯低于正常水平，并繼續維持在較低水平；而CREB和p-CREB水平在3 d后顯著升高，并繼續保持在較高水平，miR-134可通過抑制CREB和p-CREB表達抑制突觸可塑性。而Shen等〔20〕研究報道，白藜蘆醇對溫和應激誘導的認知障礙神經保護作用可能與下調miR-134、上調沉默調節蛋白(SIRT)1激活SIRT1/miR-134通路，進而上調其下游海馬區CREB/BDNF表達有關。另Chen等〔21〕研究報道，單唾液酸神經節苷脂通過上調SIRT1、p-CREB、BDNF表達激活發育中的雄性大鼠海馬中SIRT1/CREB/BDNF通路，改善鉛誘導的認知缺陷和腦損傷。本研究結果發現，與NC組比較，s-rTMS組miR-134相對表達量顯著降低；與s-rTMS組比較，rTMS組miR-134相對表達量顯著增加。CREB是核轉錄因子，被磷酸化活化后可進一步激活其下游靶基因BDNF表達，影響神經元的可塑性及遞質合成，CREB/BDNF信號通路是抑郁樣行為及認知功能障礙性疾病中重要相關通路〔22〕。提示低頻rTMS可抑制癲癇大鼠抑郁、焦慮樣行為可能與調控miR-134/CREB/BDNF通路有關，但miR-134是直接靶向CREB/BDNF通路還是通過靶向SIRT1間接影響CREB/BDNF通路在抑郁、焦慮樣行為中起作用有待進一步驗證。

綜上，低頻rTMS可減輕癲癇大鼠抑郁、焦慮樣行為，可能與調控miR-134/CREB/BDNF通路有關。