羅哌卡因?qū)m頸癌細胞C-33A生長、侵襲和間質(zhì)轉(zhuǎn)換的影響及裸鼠移植瘤生長的調(diào)節(jié)

陳洪霞 葉元梅 何光權(quán) 任普圣 康道林 趙蕾 楊玉萍

(1川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科，四川 南充 637000；2蘭州大學第一醫(yī)院麻醉科；3南充市中心醫(yī)院麻醉科；4南充市西充縣婦幼保健院婦產(chǎn)科)

宮頸癌是全世界女性中第四大最常見的腫瘤類型，也是癌癥相關(guān)死亡的第四大主要原因〔1〕。人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌的主要原因之一，通過細胞學篩查和HPV DNA檢測可以降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡率，但宮頸癌許多患者在晚期在才被診斷，這些患者的預后極差，5年生存率不到40%〔2〕。宮頸癌的治療包括手術(shù)切除，放射治療及化學療法，但是，沒有標準療法可用于轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者〔3〕。近年來研究〔4，5〕發(fā)現(xiàn)，在手術(shù)過程中使用的麻醉藥物可以在一定程度上抑制癌癥的復發(fā)，因此探討麻醉藥對宮頸癌細胞的影響具有重要意義。

羅哌卡因是一種氨基酰胺長效局部麻醉藥，臨床上常用于腹腔內(nèi)噴灑與切口浸潤可明顯減輕宮頸癌患者術(shù)后疼痛〔6〕。越來越來多研究表明，羅哌卡因?qū)δ[瘤具有抑制作用，如通過調(diào)控Na+通道的開放明顯抑制結(jié)腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力〔7〕，抑制乳腺癌細胞株MDA-MB-231增殖能力〔8〕。但羅哌卡因?qū)m頸癌具體作用機制還未見報道，本文旨在探究羅哌卡因?qū)m頸癌細胞C-33A生長、侵襲和間質(zhì)轉(zhuǎn)換的影響及裸鼠移植瘤生長的影響。

1 材料和方法

1.1試驗藥物和主要試劑 羅哌卡因(S68348)購自上海源葉生物科技有限公司，化學式：C17H26N2O，分子量：274.4 D，純度≥98%；RPMI1640培養(yǎng)基(61870-127)、青霉素-鏈霉素溶液(15140-122)、胎牛血清(26400-036)和胰蛋白酶(25200-056)均購自美國Gibco 公司；細胞計數(shù)試劑(CCK)-8試劑盒(G021-1-1)、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記(TUNEL)細胞凋亡原位檢測試劑盒(G002-1-2)購自南京建成生物工程研究所；5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EDU)細胞增殖檢測試劑盒(C0085L)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(P0012)和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(A0208)均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Transwell(353090)購自美國BD公司；兔抗單克隆抗體纖維黏連蛋白(Fibronectin,ab2413)、波形蛋白(Vimentin，ab194719)和GAPDH(ab37168)均購自英國Abcam公司。

1.2細胞培養(yǎng) 人子宮頸癌C-33A細胞株來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中用高糖RMPI1640培養(yǎng)基(含10 %胎牛血清和1 %青霉素-鏈霉素)培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)基，收集細胞時用0.25%胰蛋白酶消化，試驗選用對數(shù)生長期細胞。

1.3CCK-8 選用對數(shù)生長期細胞，將宮頸癌C-33A細胞以100 μl/孔接種于96孔板中孵育24 h，加入不同劑量羅哌卡因(0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000、2.500、5.000 mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μl CCK-8溶液避光孵育4 h，用酶標儀在450 nm處測定各孔的OD值并計算細胞存活率，根據(jù)細胞存活率計算IC50值。

1.4細胞處理及分組 根據(jù)方法1.3結(jié)果，選擇1 mmol/L劑量羅哌卡因為最高劑量，數(shù)遞減劑量確定給藥梯度為：1.00、0.50、0.25 mmol/L。將細胞隨機分為4組：羅哌卡因0.00 mmol/L組、羅哌卡因0.25 mmol/L組、羅哌卡因0.50 mmol/L組和羅哌卡因1.00 mmol/L組。

1.5EDU染色 取對數(shù)生長期的C-33A細胞以每孔1×105接種于96孔板，培養(yǎng)過夜，在每孔中加入100 μl含50 μmol/L EDU培養(yǎng)基孵育2 h，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，每次5 min。將細胞進行固定和染色后用熒光顯微鏡進行觀測。

1.6Transwell檢測細胞侵襲 將各組C-33A細胞接種至Transwell上室中，于下室中加入無血清培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出Transwell用PBS沖洗2次，5% 戊二醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色0.5 h后于熒光顯微鏡下觀測，隨機選擇5個視野對細胞進行計數(shù)，侵襲細胞數(shù)為每視野的平均細胞數(shù)。

1.7上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)形態(tài)學觀察 取對數(shù)生長期各組細胞，將各組細胞置于倒置顯微鏡中以觀察EMT形態(tài)的改變。

1.8Western印跡 取各組對數(shù)生長期C-33A細胞，加入200 μl含0.01 mol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液提取總蛋白，并用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。取等量蛋白質(zhì)樣品，100℃變性5 min后用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在4℃條件下加入Vimentin、Fibronectin(1∶1 000)并孵育過夜，TBST清洗3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶10 000)室溫下繼續(xù)孵育2 h，TBST清洗3次，每次5 min，最后加入電化學發(fā)光(ECL)液，曝光處理。ImageJ軟件統(tǒng)計灰度值。以目的條帶灰度值/GAPDH灰度值表示蛋白表達水平。

1.9裸鼠移植瘤模型的建立 10只雄性無特定病原體(SPF)級別Balb/c裸鼠，5周齡，體重(16±2)g購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0009。參照周慧等〔9〕方法，建立宮頸癌裸鼠移植瘤模型，取對數(shù)生長期C-33A細胞，調(diào)整細胞濃度為1×107，于裸鼠右側(cè)腋窩處皮下注射0.2 ml細胞懸液。18 d后瘤體直徑>0.5 cm為造模成功。將裸鼠隨機分為2組：羅哌卡因0.0 mg/kg組和羅哌卡因0.3 mg/kg組〔10〕。分別灌胃給藥羅哌卡因0.0、0.3 mg/kg每天1次，連續(xù)30 d。末次給藥24 h后處死所有大鼠，稱取腫瘤重量。取各組裸鼠腫瘤組織用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，切片厚度為5 μm。

1.10TUNEL染色 將裸鼠腫瘤組織切片用二甲苯浸洗2次脫蠟，每次5 min，梯度乙醇脫水。用蛋白酶K工作液在37℃下封閉20 min，PBS清洗2次。在每個切片樣本上加入50 μl TUNEL反應液，37℃避光孵育60 min。用DAPI復染10 min后于熒光顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野，每個視野分別計數(shù)凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)，細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.11免疫組化 取各組裸鼠腫瘤組織，常規(guī)石蠟包埋制成厚度約4 μm的切片，按免疫組化檢測試劑盒說明書進行免疫組化染色，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分色。使用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)分析Vimentin陽性細胞占比，陽性細胞率=陽性細胞數(shù)目/總細胞計數(shù)×100%。

1.12統(tǒng)計學分析 使用GraphPad Prism5軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1羅哌卡因降低C-33A細胞細胞存活率 通過CCK-8法檢測不同劑量羅哌卡因?qū)-33A細胞細胞存活率的影響，與0.010 mmol/L劑量〔(100.00±4.34)%〕比較，0.500、1.000、2.500、5.000 mmol/L劑量羅哌卡因細胞存活率顯著降低〔(54.76±7.99)%、(30.03±6.07)%、(17.77±5.16)%、(9.31±8.25)%，均P<0.05〕，0.025、0.050、0.100、0.250 mmol/L劑量羅哌卡因細胞存活率無明顯變化〔(99.11±5.13)%、(94.09±4.22)%、(90.78±5.67)%、(84.22±6.12)%，均P>0.05〕。通過計算得出羅哌卡因?qū)-33A細胞細胞存活率的IC50值為1.094。

2.2羅哌卡因降低C-33A細胞增殖EDU陽性細胞數(shù) 通過EDU染色檢測各組細胞增殖結(jié)果如圖1所示，與羅哌卡因0.00 mmol/L組〔(93.31±7.67)個〕相比較，羅哌卡因0.25 mmol/L組EDU陽性細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義〔(88.22±9.35)個,P>0.05〕，羅哌卡因0.50、1.00 mmol/L組EDU陽性細胞數(shù)顯著降低〔(34.13±6.73)個、(12.98±8.41)個，均P<0.05〕。

2.3羅哌卡因抑制C-33A細胞侵襲 通過Transwell檢測各組細胞侵襲結(jié)果如圖2所示，與羅哌卡因0.00 mmol/L組〔(116.31±17.13)個〕比較，羅哌卡因0.25 mmol/L組侵襲細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義〔(107.96±12.65)個，P>0.05〕，羅哌卡因0.50、1.00 mmol/L組侵襲細胞數(shù)顯著降低〔(39.77±14.18)個、(16.97±9.56)個，均P<0.05〕。

2.4羅哌卡因抑制C-33A細胞EMT，下調(diào)Vimentin、Fibronectin蛋白表達水平 羅哌卡因0.00 mmol/L組較羅哌卡因0.50、1.00 mmol/L組細胞呈連接松散的類圓或紡錘體樣，發(fā)生了典型的EMT，見圖3。與羅哌卡因0.00 mmol/L組比較，羅哌卡因0.25 mmol/L組Vimentin、Fibronectin蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，羅哌卡因0.50、1.00 mmol/L組Vimentin、Fibronectin蛋白水平顯著降低(均P<0.05)。見圖4，表1。

圖1 各組細胞增殖(EDU染色，×200)

圖2 Transwell檢測各組細胞侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)

圖3 熒光顯微鏡下觀測各組細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(×200)

1～4：羅哌卡因0.00 mmol/L組、羅哌卡因0.25 mmol/L組、羅哌卡因0.50 mmol/L組、羅哌卡因1.00 mmol/L組圖4 Western印跡檢測Vimentin、Fibronectin蛋白表達水平

表1 羅哌卡因?qū)-33A細胞EMT和Vimentin、Fibronectin蛋白表達水平的影響

2.5羅哌卡因?qū)β闶笠浦擦龅挠绊?與羅哌卡因0.0 mg/kg組比較，羅哌卡因0.3 mg/kg組第25、30天腫瘤體積顯著變小(P<0.05)；與羅哌卡因0.0 mg/kg組比較，羅哌卡因0.3 mg/kg組腫瘤重量顯著降低、細胞凋亡率顯著升高、Vimentin陽性細胞數(shù)顯著降低(均P<0.05)。見圖5、圖6、表2、表3。

圖5 羅哌卡因?qū)β闶笠浦擦龅挠绊?/p>

圖6 TUNEL染色檢測細胞凋亡(×200)及免疫組化檢測Vimentin陽性細胞數(shù)(×200)

表2 羅哌卡因?qū)β闶笠浦擦瞿[瘤體積的影響

表3 羅哌卡因?qū)β闶笠浦擦瞿[瘤重量、細胞凋亡率和Vimentin陽性細胞數(shù)的影響

3 討 論

宮頸癌是婦科腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著女性生命健康〔11〕。既能有效鎮(zhèn)痛又能抑制腫瘤細胞復發(fā)轉(zhuǎn)移的藥物是臨床上麻醉與鎮(zhèn)痛所追求的理想目標。羅哌卡因作為長效局麻藥物，因毒性較低，起效快，在宮頸癌手術(shù)中的生物安全性已得到認可。本研究結(jié)果提示羅哌卡因可抑制宮頸癌裸鼠移植瘤模型腫瘤的生長。

癌細胞過度增殖是宮頸癌病灶內(nèi)重要的生物學特征，即抑制癌細胞增殖是治療宮頸癌的必要方式。已有研究表明，局部麻醉藥可抑制癌細胞的增殖，誘導癌細胞凋亡，避免全麻藥物對機體免疫功能的損傷〔12〕。夏明等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)羅哌卡因通過下調(diào)(TCF)-4和beta-catenin蛋白表達抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖。Bundscherer等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)高濃度的羅哌卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞顯示出抗增殖能力。本研究發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因具有降低C-33A細胞EDU陽性細胞數(shù)的作用。提示羅哌卡因抑制C-33A細胞增殖。

侵襲是所有惡性腫瘤的特征性生物學行為，關(guān)系著疾病的發(fā)展和預后。盡管宮頸癌有相對成熟的手術(shù)、放療和化療治療方案，但侵襲和轉(zhuǎn)移仍是中晚期宮頸癌治療失敗的主要原因。Vogelaar等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)羅哌卡因可抑制結(jié)腸癌細胞侵襲和遷移。Piegeler等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)羅哌卡因通過阻斷蛋白激酶B(Akt)和黏著斑激酶的激活來抑制腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導的肺腺癌細胞侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因具有降低C-33A細胞侵襲細胞數(shù)的作用。提示羅哌卡因抑制C-33A細胞侵襲。

EMT是上皮表型細胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)表型細胞的過程，EMT通過與基底膜相互作用，使間充質(zhì)細胞處于更多的運動狀態(tài)，升高間充質(zhì)細胞的遷移能力、侵襲性和提高對細胞凋亡的抗性〔17〕。已有研究表明EMT可促進宮頸癌細胞的遷移、侵襲，進而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移，影響患者的預后〔18〕。EMT的主要特點是上皮細胞標志蛋白E-Cadherin表達的降低，和間充質(zhì)細胞標志蛋白N-Cadherin及Vimentin表達的升高〔19〕。Fibronectin是間充質(zhì)細胞標志物，為細胞外基質(zhì)糖蛋白，對細胞黏附、遷移和生長具有重要的調(diào)控作用，在宮頸癌中表現(xiàn)為表達上調(diào)〔20〕。本研究發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因具有下調(diào)C-33A細胞Vimentin、Fibronectin蛋白表達水平和降低裸鼠移植瘤模型Vimentin陽性細胞數(shù)的作用。提示羅哌卡因抑制宮頸癌細胞EMT。