miR-21通過Bcl-2和P53對早期胃癌病理形態學的影響

危柳柳 賴月亮 朱方擎 林曄 謝俊峰

(贛州市人民醫院，江西 贛州 341000)

早期胃癌被定義為腺癌局限于胃黏膜或黏膜下層淋巴結存在或不存在轉移，其生物學行為與進展期胃癌相比相對良性，目前尚不清楚在2個腫瘤之間是否存在不同的致癌途徑，是否與癌癥發生的早期和晚期有關〔1，2〕。在胃的發育過程中，胃上皮細胞凋亡的平衡增殖受到干擾，過度的B細胞淋巴瘤(Bcl)-2原癌基因和突變P53蛋白積累〔3〕，兩者都在胃癌前病變向癌的進展和轉移的調節細胞動力學中起著至關重要的作用〔4〕。大多數早期和晚期胃上皮細胞的轉化癌癥數據來自日本和東亞，來自西方的人口是有限的〔5〕。本研究探討miR-21通過Bcl-2和P53對早期胃癌病理形態學的影響。

1 資料與方法

1.1臨床標本 江西省贛州市人民醫2018年1月至2019年7月期間接受治療的早期胃癌患者60例。早期胃癌納入標準：①依據為病理，確診為早期胃癌；②尚未發生早期胃癌細胞轉移；③年齡48～60歲；④所有患者知情并簽署同意書。排除標準：①處于復發性早期胃癌；②術前檢查有感染和轉移；③有其他惡性腫瘤合并；④有肝腎、心血管系統等重大疾病。從每例患者身上取得的癌組織于半小時內分別放入10%甲醛溶液中固定并且石蠟包埋。

1.2主要材料 免疫組化皆使用單克隆抗體，Envision染色系統、抗Bcl-2、抗P53(美國BMI公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色，無水乙醇，稀氨水，二甲苯。

1.3分組 60例早期胃癌患者取得的癌組織通過增加和減少miR-21表達水平分為過表達miR-21組和敲低miR-21組各30例，并隨機選取兩組各15例患者的癌旁正常組織作為對照組(30例)。

1.4Western印跡 使用RIPA緩沖液(Solarbio，R0010，上海)和抑制劑混合物(Sigma，P8340-5ML，St.Louis，MO，USA)提取細胞和組織的總蛋白質并測定通過二喹啉甲酸(BCA)蛋白質測定法測定蛋白質濃度(SBJ-1001；Beyotime，SENBEIJIA Bio，南京)〔6〕。加入上樣緩沖液以調節濃度。變性后，向每個樣品孔中加入20 μg。使用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS、PAGE)分離蛋白質樣品，然后在電泳和跨膜后用聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉移相應的蛋白質，用脫脂乳密封2 h〔7〕。將膜與抗-Smurf1(PB0937，1∶1 000；武漢博士德生物技術有限公司，武漢)和抗β-微管蛋白(2146，1∶1 000；Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA)一起孵育初級抗體〔8〕。β-微管蛋白用作上樣對照。在4℃下過夜孵育。將PVDF膜洗滌3次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔抗體(抗兔IgG，HRP連接抗體6402-05，1∶5 000；Amylet Scientific Inc，武漢)，并在37℃溫育。持續1～2 h。使用電化學發光(ECL)著色劑(Haigene，M2301，哈爾濱)使條帶可視化〔9〕。分析靶蛋白β-微管蛋白的灰度比，表明目標蛋白質的相對含量。

1.5免疫組化 針對結直腸癌組織的免疫組化，樣本取自癌癥最具侵襲性的區域〔9〕。將標本固定在10%甲醛溶液中，包埋在石蠟中，并切成4 μm厚的切片。4 μm厚的切片在二甲苯中脫蠟，并在分級系列乙醇中再水合。切片用2%脫脂乳和5%牛血清白蛋白在磷酸鹽緩沖鹽水中孵育，以阻斷免疫試劑的非特異性結合。隨后，在室溫下與單克隆抗MMPs抗體作為一級抗體。然后，用0.3% H2O2處理，抑制內源性過氧化物酶活性30 min，并進行標記鏈霉親和素生物素技術。用二氨基聯苯胺(DAB)作為顯色劑，對其進行評估。

1.6組織學評估 基于德國免疫反應評分〔10〕。染色強度的等級從0到3，0、1、2或3分別表示無染色、弱染色、中等染色或強染色。陽性細胞的百分比評分如下：無染色為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。通過將染色強度所得的分數乘以陽性細胞百分比所得的分數來計算最終分數，結果范圍為0～12分。為了將強度評分與臨床病理因素進行比較，最終評分0～5分被認為是低表達，6～12分被為高表達。組織學和免疫組化評估由2名不知道患者臨床特征的觀察者獨立進行。在觀察者意見不一致的情況下，評估由額外的觀察者進行。

1.7HE染色 將早期胃癌組織切片，二甲苯Ⅰ脫蠟進行10 min，此后用二甲苯Ⅱ脫蠟5 min，完成之后用無水乙醇洗去二甲苯，重復清洗3遍，用95%乙醇清洗1 min，90%乙醇清洗1 min，最后用蒸餾水清洗掉乙醇。用蘇木素進行染色，保持1 min，再用清水洗滌1 min，1%鹽酸酒精分化20 s，清水洗滌3 min，再用1%氨水反藍30 s，清水洗滌1 min，伊紅染色20 s，清水洗滌1 min，然后用85%乙醇脫水20 s，90%乙醇脫水30 s，95%乙醇Ⅰ脫水1 min，95%乙醇Ⅱ 1 min，無水乙醇Ⅰ脫水2 min，無水乙醇Ⅱ脫水2 min，無水乙醇Ⅲ脫水2 min，最后分別用二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ處理2 min，用中性樹膠封片完成即可。

1.8統計學分析 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、χ2檢驗。

2 結 果

2.1miR-21通過Bcl-2和P53對癌組織HE染色的影響 過表達miR-21組胃體和胃竇部黏膜炎癥較輕，輕微水腫，上皮細胞壞死脫落，黏膜淺層有淋巴細胞浸潤，固有腺體完整；敲低miR-21組病變黏膜固有層內慢性炎細胞浸潤，深達黏膜肌層，血管增生，基底部腺體上皮增生，出現共壁現象。見圖1。過表達miR-21組的病理組織學情況顯著優于敲低miR-21組(P<0.05)。見表1。

2.2miR-21通過Bcl-2和P53對癌組織免疫組化的影響 過表達miR-21組中小部分細胞的胞質染色，呈黃色、棕黃色、棕色、褐色；敲低miR-21組中大部分細胞染色，呈棕色和褐色，在不典型增生、腸化生細胞中呈深褐色。見圖2。

圖1 miR-21通過Bcl-2、P53對癌組織HE染色的影響(×200)

表1 兩組病理組織學情況對比(n=30)

圖2 miR-21通過Bcl-2、P53對癌組織免疫組化的影響(×200)

2.3各組Bcl-2、P53的蛋白表達比較 與對照組Bcl-2、P53蛋白表達(0.48±0.03、0.38±0.07)相比，過表達miR-21組Bcl-2蛋白表達(0.17±0.02)顯著降低，P53蛋白表達(0.96±0.13)顯著上升(P<0.05)；敲低miR-21組Bcl-2蛋白表達(0.63±0.04)顯著上升，P53蛋白表達(0.27±0.04)顯著降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組Bcl-2和P53蛋白表達

3 討 論

早期胃癌患者進行手術后的生存率可超過90%〔11〕，而轉移性早期胃癌患者的淋巴結有1%～3%的局限于胃黏膜，11%～20%局限于胃黏膜下層〔12〕。 診斷是指經驗豐富的中心使用高靈敏度和特異性的內鏡對腫瘤的浸潤程度進行評估〔13〕，判斷癌癥的發展進程。對胃癌患者進行早診斷、早治療能夠大大提高胃癌患者的生存率、預后水平，因此研究相關診斷指標對胃癌臨床治療具有重要意義〔14〕。

目前只有少數指標被報道可用于胃癌早期診斷，最近有報道表明，細胞凋亡的相關基因對胃癌的發展及預后有影響〔15〕。Bcl-2蛋白被報道能夠通過阻斷程序性細胞死亡延長各種細胞的存活時間，有研究表明，Bcl-2過表達能夠促進胃上皮異常增生，導致胃上皮細胞的惡性轉化〔16〕。另外，P53是正常細胞增殖的重要調控因子，野生型P53基因是一種抑癌基因，能夠修復損傷的DNA、促進細胞凋亡〔17〕，但突變型P53基因是一種癌基因，抑制細胞凋亡、促進癌細胞增殖，突變型P53 蛋白質常被免疫組化檢測〔18〕，有西方學者研究表明，P53蛋白在晚期胃癌的表達中高于早期胃癌〔19，20〕，提示P53蛋白在胃癌發展進程中具有重要作用。目前已知，miR-21在多種腫瘤組織中均呈現高表達，且能夠作用于Bcl-2與P53等靶點。

本研究結果顯示，miR-21在早期胃癌組織內的過表達會顯著升高腫瘤組織內P53蛋白的表達量、降低Bcl-2蛋白的表達量，而高表達P53蛋白和低表達的Bcl-2蛋白都能起到促進癌細胞凋亡的作用，二者共同發揮抑癌作用優化了胃癌組織的病理學形態，延緩了早期胃癌的發展進程，說明在臨床能夠通過檢測或調控miR-21水平對早期胃癌患者進行診斷治療。

綜上，miR-21能夠通過升高P53表達、降低Bcl-2表達改善早期胃癌患者胃內理化環境，減少理化損傷，miR-21也可以作為早期胃癌檢查的指標，對患者的臨床治療有一定意義，但本研究設計并未涉及對于Bcl-2與P53作用機制的研究，關于miR-21通過Bcl-2和P53對早期胃癌的作用機制有待于進一步研究。