lncRNA GAS5調控miR-21抑制人骨髓間充質干細胞成骨分化

王冠賢 李寶林 唐愛民 黃永湘

(儋州市人民醫院骨科，海南 儋州 571700)

骨缺損是常見的臨床問題，主要由創傷，生理性、病理性骨吸收導致〔1〕。在整形外科中，需要通過骨再生修復缺損提高患者的生活質量，而在一些骨疾病中，需要通過骨再生治療恢復丟失的骨量〔2，3〕。人骨髓間充質干細胞(hBMSC)是具有多種分化潛能的細胞，主要向成骨細胞、脂肪細胞分化，對調控骨組織重建、代謝有重要作用〔4，5〕。微小RNA(miRNA)是一類由18～25個核苷酸組成的非編碼小分子RNA，通過調控靶基因的表達，影響細胞的增殖、凋亡、分化等過程〔6〕。研究發現，miR-21在hBMSC的成骨分化調控中起重要作用〔7〕。長鏈非編碼RNA(lncRNA)生長特異抑制物(GAS)5作為一種lncRNA，與miR-21存在互補區域，可以競爭性與miR-21結合形成沉默復合體，進而影響miR-21發揮作用〔8〕。但lncRNA GAS5在成骨分化方面尚缺乏研究。本研究旨在探討lncRNA GAS5調控miR-21對hBMSC成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 hBMSC細胞(批號：os101059)購自美國ATCC細胞庫；α-MEM培養基(批號：MEP10-10LT)購自美國Caisson Labs公司；Lipofectamine 2000轉染試劑(批號：11668019)購自美國Invitrogen公司；TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒(批號：R0016、D7168S)購自上海碧云天生物技術有限公司；蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒(批號：BB-3009、BB2108)購自上海貝博生物科技公司；實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒(批號：K1002S)購自美國Promega公司；成骨分化試劑盒(批號：A1007201)購自美國GIBCO公司；堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒(批號：121862)購自北京凱瑞基生物科技有限公司；ALP活性測定試劑盒(批號：8258)購自美國Sciencell公司；Runt相關轉錄因子(RUNX)2抗體、骨形態發生蛋白(BMP)2抗體、骨唾液蛋白(BSP)抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(批號：ab76956、ab14933、ab52128、ab181602)購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(批號：0295G-HRP)購自美國Santa公司；negative control-GAS5、GAS5 mimic、nonsense siRNA、GAS5 siRNA序列及GAS5、miR-21、RUNX2、BMP2、BSP、ALP、U6、GAPDH引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；恒溫培養箱(型號：MIR-162-PC/MIR-262-PC)購自日本松下公司；顯微鏡(型號：CX31)購自日本Olympus公司；酶標儀(型號：ChemiDocXRS)、化學發光成像系統(型號：MODEL550)購自美國Bio-Rad公司；熒光定量PCR儀(型號：ABI 7500)購自美國Applied Biosystems公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養 含有10%胎牛血清的α-MEM培養基將hBMSC制成單細胞懸液，接種于多聚賴氨酸包被的T-75培養瓶，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。次日更換培養基，此后每3天更換1次培養基。待細胞融合率達到85%左右時，用胰蛋白酶消化、傳代培養。將對數期hBMSC以1×104個/孔接種于96孔培養板，分為：對照組、mimic NC組、GAS5 mimic組、siRNA NC組和GAS5 siRNA組，其中對照組hBMSC不進行轉染，mimic NC組、GAS5 mimic組、siRNA NC組和GAS5 siRNA組hBMSC使用Lipofectamine 2000轉染試劑分別轉染negative control-GAS5、GAS5 mimic、nonsense siRNA、GAS5 siRNA。

1.2.2qRT-PCR檢測各組hBMSC中lncRNA GAS5、miR-21及成骨相關因子mRNA表達情況 將轉染處理后的hBMSC培養48 h，收集細胞，qRT-PCR檢測lncRNA GAS5、miR-21表達水平，內參基因為U6、GAPDH；將轉染處理后的hBMSC誘導成骨分化培養7 d，收集細胞，qRT-PCR檢測RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA表達水平，內參基因為GAPDH。使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，反應程序：95℃預變性10 min；95℃變性10 s，55℃退火35 s，72℃延伸1 min，循環40次。引物lncRNA GAS5上游：5′-AAGCCATTGGCACAGGCATTAG-3′，下游：5′-AGAACCATTAAGCTGGTCCAGGCA-3′；miR-21上游：5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′，下游：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；內參U6上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；內參GAPDH上游：5′-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游：5′-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3′；RUNX2上游：5′-TTCACCTTGACCATAACCGTC-3′，下游：5′-GGCGGTCAGAGAACAAACTAG-3′；BMP2上游：5′-GGTATCACGCCTTTTACTGCC-3′，下游：5′-ACACCCACAACCCTCCACAA-3′；BSP上游：5′-CACTGGAGCCAATGCAGAAGA-3′，下游：5′-TGGTGGGGTTGTAGGTTCAAA-3′；ALP上游：5′-AGAATCTGGTGCAGGAATGG-3′，下游：5′-TCGTATTTCATGTCTCCAGGC-3′。相對表達量均以2-ΔΔCt法表示，Ct值為擴增產物的熒光信號達到臨界閾值時對應的循環數。

1.2.3各組hBMSC ALP染色情況 經轉染處理后，將hBMSC誘導成骨分化培養7 d，按ALP染色試劑盒說明書進行ALP染色。棄上清液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，4%多聚甲醛固定30 s，PBS洗滌，每孔加500 μl顯色反應液，37℃避光孵育30 min，蒸餾水漂洗直至不再脫色，顯微鏡照相。

1.2.4各組hBMSC ALP活性檢測 經轉染處理后，將hBMSC誘導成骨分化培養7 d，PBS洗滌，加入30 μl/孔細胞裂解液振蕩裂解30 min，加入50 μl/孔緩沖液及50 μl/孔基質液，混勻后37℃恒溫水浴15 min，加入150 μl顯色劑，在酶標儀520 nm波長處測定每孔的ALP活性。

1.2.5Western印跡檢測各組hBMSC中成骨相關因子蛋白表達 經轉染處理后，將hBMSC誘導成骨分化培養7 d，收集細胞，使用蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度并進行定量。電泳分離等量蛋白質并轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，分別加入RUNX2抗體、BMP2抗體、BSP抗體、GAPDH抗體(均為1∶500)，4℃孵育過夜，TBST洗滌后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，免疫反應化學發光法顯色，Tanon 600圖像分析系統拍攝圖像并分析條帶灰度，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值。

1.3統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組hBMSC中lncRNA GAS5、miR-21表達情況 對照組、mimic NC組、siRNA NC組間hBMSC中lncRNA GAS5、miR-21表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；與mimic NC組相比，GAS5 mimic組hBMSC中lncRNA GAS5水平顯著升高(P<0.05)，miR-21水平顯著降低(P<0.05)；與siRNA NC相比，GAS5 siRNA組hBMSC中lncRNA GAS5水平顯著降低(P<0.05)，miR-21水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組hBMSC中lncRNA GAS5、miR-21表達水平比較

2.2各組hBMSC中成骨相關因子mRNA表達情況 對照組、mimic NC組、siRNA NC組間hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；與mimic NC組相比，GAS5 mimic組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA水平顯著降低(均P<0.05)；與siRNA NC相比，GAS5 siRNA組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA水平顯著升高(均P<0.05)。見表2。

2.3各組hBMSC中ALP染色情況 對照組、mimic NC組、siRNA NC組間hBMSC細胞ALP染色無明顯差異；與mimic NC組相比，GAS5 mimic組hBMSC細胞ALP染色明顯減弱；與siRNA NC組相比，GAS5 siRNA組hBMSC細胞ALP染色明顯增強。見圖1。

2.4各組hBMSC中ALP活性 對照組、mimic NC組、siRNA NC組間hBMSC中ALP活性差異無統計學意義(P>0.05)；與mimic NC組相比，GAS5 mimic組hBMSC中ALP活性顯著降低(P<0.05)；與siRNA NC相比，GAS5 siRNA組hBMSC中ALP活性顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.5各組hBMSC中成骨相關因子蛋白表達情況 對照組、mimic NC組、siRNA NC組間hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；與mimic NC組相比，GAS5 mimic組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與siRNA NC相比，GAS5 siRNA組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見表3、圖2。

表2 各組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA水平及ALP活性比較

圖1 各組hBMSC中ALP染色

表3 各組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表達水平比較

1～5：對照組、mimic NC組、GAS5 mimic組、siRNA NC組、GAS5 siRNA組圖2 各組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表達情況

3 討 論

骨缺損是全球性的健康問題，與創傷及骨質疏松、骨折等多種骨疾病的發生有關。研究表明，骨主要包括促進骨形成的成骨細胞和促進骨吸收的破骨細胞，是一個連續的動態平衡組織，在正常的骨組織中，兩種細胞處于平衡狀態，一旦平衡打破，成骨細胞的骨生成低于破骨細胞的骨吸收，就會導致骨破壞疾病的發生〔9，10〕。骨再生是由成骨細胞、破骨細胞、其他多種細胞及細胞因子共同參與的復雜修復過程，是破骨細胞介導骨吸收及成骨細胞介導的骨形成的一個動態平衡過程。hBMSC是骨組織工程的重要種子細胞，具有自我克隆增殖及向成脂細胞、成骨細胞等分化的能力，臨床常通過體外誘導使hBMSC分化成軟骨、成骨細胞等，在多種疾病的治療中發揮作用〔11〕。lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的RNA分子，缺乏較明顯的開放閱讀框，具有較低甚至不具有翻譯蛋白質的功能，通過介導表觀遺傳修飾、轉錄調控、轉錄后調控及其他的特定調控模式發揮作用〔12〕。研究發現，許多lncRNA與成骨細胞、破骨細胞相關，參與骨再生過程的調控，同時與骨關節炎的發生、發展有著密切的聯系〔13,14〕。Li等〔15〕發現lncRNA GAS5的表達在骨關節炎軟骨中上調，并且可能通過上調基質金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-13、BMP-2和ADAMTS5 mRNA表達水平促進骨關節炎的發生發展。Song等〔16〕發現lncRNA GAS5在骨關節炎軟骨細胞中表達上調，可能通過增加幾種MMPs的表達水平，影響軟骨退化和骨關節炎進展。本研究結果提示GAS5可能影響成骨分化過程中ALP、RUNX2、BMP2、BSP等成骨分化標志基因的轉錄、翻譯水平，在hBMSC成骨分化過程中起負向調節作用〔17〕。研究表明，miRNA在細胞凋亡、分化等生理病理過程中有重要作用。彭建強等〔18〕研究表明，miR-21可外調控MC3T3-E1細胞成骨分化，在骨形成過程發揮作用。宋琪玲等〔19〕研究表明，miR-21可以通過增強BMP9/Smad信號通路的激活程度，促進hBMSC C3H10T1/2細胞成骨分化過程。而鄭偉等〔20〕研究發現，LncRNA-GAS5作為miR-21的“分子海綿”，通過“吸收”miR-21從而調控miR-21對靶基因的抑制。本研究結果提示在hBMSC中，GAS5可能通過調控miR-21，進而影響hBMSC細胞的成骨分化過程。

綜上，lncRNA GAS5在hBMSC成骨分化過程中發揮負向調控作用，可能與抑制miR-21表達有關。lncRNA GAS5有望作為成骨分化的調控靶點，但將其應用在骨再生臨床治療中，還需進一步在體內進行驗證。