陰陽雙補方治療骨轉移癌作用機制探討*

楊夢霞 蘆殿榮 朱世杰 周 磊

（1.中國中醫科學院望京醫院，北京 100102；2.北京中醫藥大學，北京 100029）

骨骼是腫瘤細胞轉移最主要的目標器官之一，轉移率僅次于肺和肝[1]。約2/3晚期惡性腫瘤患者會發生骨轉移[2]，在臨床上主要表現為局部持續性進行性刺痛和明顯的壓痛、病理性骨折、椎體轉移的脊髓壓迫、高血鈣等，嚴重影響了患者一般機體狀況和生活質量，縮短生存期[3]。目前西醫多采用放療、手術及藥物治療等姑息療法，但臨床應用局限且存在許多不良事件，如：骨折、低血鈣癥和頜骨壞死等[4]。近年來，中醫藥在改善腫瘤患者生活質量、緩解臨床癥狀、延長生存期等方面具有顯著優勢，且療效明確，不良反應少[5]。歷代中醫學者認為腫瘤骨轉移多是腎精虧虛、骨失濡養所致。本研究團隊通過總結全國名老中醫李佩文教授臨床用藥經驗發現，歸腎經方——陰陽雙補方對骨轉移防治具有較好的臨床療效，但其作用機制尚未清楚。故本研究擬基于網絡藥理學方法初步探討陰陽雙補方治療骨轉移癌的理論內涵，以便為今后臨床用藥提供更多參考依據。

1 材料與方法

1.1 陰陽雙補方主要有效成分篩選 在中藥數據庫TCMSP（http：//lsp.Nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）中檢索陰陽雙補方（由補骨脂、骨碎補、肉蓯蓉、淫羊藿、透骨草、山茱萸、山藥、熟地黃組成）有效成分，保留OB≥30%且DL≥0.18的成分；同時，借助TCMID（http：//www.mega-bionet.org/tcmid/）及TCM Database@Taiwan（http：//tcm.cmu.edu.tw/）中藥數據庫對檢索不到有效成分的藥物進行補充。

1.2 陰陽雙補方潛在靶點預測 在PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索陰陽雙補方主要有效成分所對應的化學結構，并在Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）中，以“Homo sapiens”為檢索條件，保留“Probability＞0.1”的潛在靶點；最后使用Cytoscape3.8.2中的MCODE（Version1.4.2，Bader Lab，University of Toronto）插件，篩選出重要模塊基因并進行可視化分析。

1.3 骨轉移癌疾病基因篩選 在Drugbank（http：//www.drugbank.ca/）和DisGeNet（http：//www.disgenet.org/）疾病基因數據庫中，查詢骨轉移癌疾病基因，并在Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數據庫中將基因標準化。

1.4 陰陽雙補方針對骨轉移癌的潛在治療靶點預測 通過韋恩映射篩選出潛在治療靶點，同時使用STRING11.5（https：//string-db.org/）數據庫構建基因功能關聯網絡，并在Cytoscape3.8.2中可視化，同時利用MCODE插件篩選出核心靶點。

1.5 潛在治療靶點功能分析 使用DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）分別對潛在治療靶點進行GO及KEGG通路富集分析，并將結果可視化（FDR＜0.05）。

2 結果

2.1 陰陽雙補方主要有效成分 在中藥數據庫中檢索到陰陽雙補方主要有效成分共88個（補骨脂4個、骨碎補17個、肉蓯蓉6個、淫羊藿23個、透骨草7個、山茱萸肉14個、山藥15個、熟地黃2個），見表1（僅列出每位藥OB值排名前5的有效成分）。

表1 陰陽雙補方主要有效成分

2.2 陰陽雙補方潛在靶點 在Swiss Target Prediction中檢索到陰陽雙補方共包含673個靶點。將這些靶點在Cytoscape3.8.2中使用MCODE插件篩選重要模塊靶點，發現這些靶點主要位于模塊A（得分為29.568，含36個節點，547條邊）和B（得分為17.017，含58個節點，502條邊），見圖1。

圖1 陰陽雙補方潛在靶點重要模塊基因

2.3 陰陽雙補方針對骨轉移癌的潛在治療靶點 在疾病基因數據庫中檢索到骨轉移癌疾病基因有773個，與673個藥物潛在靶點進行韋恩映射，得到150個潛在治療靶點，見圖2。在STRING11.5數據庫中構建蛋白-蛋白互作網絡，并在Cytoscape3.8.2中可視化，包含145個節點，1 531條邊，見圖3A；并使用MCODE插件篩選核心靶點，取節點連接度排名前20的靶點做條形圖，見圖3B。

圖2 陰陽雙補方潛在靶點和骨轉移癌疾病基因的韋恩圖

圖3 陰陽雙補方治療骨轉移癌的潛在靶點（A）及核心靶點（B）

2.4 潛在治療靶點的GO功能分析 對150個潛在治療靶點進行GO功能富集分析，根據“FDR＜0.05”篩選得到BP48個、CC9個和MF30個。分別取BP、MF排名前10的條目及9項CC進行可視化，見圖4。在BP方面，包括蛋白質自磷酸化、肽基酪氨酸磷酸化及磷脂酰肌醇介導的信號轉導等；在CC中，涉及樹突、磷脂酰肌醇3-激酶復合物及溶酶體等；在MF方面，涉及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、神經遞質受體活性及磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶活性等。

圖4 陰陽雙補方治療骨轉移癌潛在靶點的GO功能富集分析

2.5 潛在治療靶點的KEGG功能分析 對150個潛在治療靶點進行KEGG通路富集分析，得到97條通路，根據“FDR＜0.05”篩選得到82條通路，將前30條通路進行可視化，見圖5。相關通路主要有HIF-1、Rap1、VEGF、PI3K-Akt及mTOR等信號通路。

圖5 陰陽雙補方治療骨轉移癌潛在靶點的KEGG通路富集分析

3 討論

現代醫學認為，腫瘤細胞在趨化作用下可改造骨微環境，而骨微環境也在不斷招募腫瘤細胞，進而使腫瘤細胞向骨組織定植[6]。中醫學認為腎主骨生髓，故骨轉移患者多從腎論治。本研究團隊根據李老治療骨轉移臨床用藥經驗，選取常用補腎類中藥加減化裁組成“陰陽雙補方”，方中補骨脂、骨碎補補腎助陽，肉蓯蓉補腎溫陽，益精血，3藥相輔相成，培補腎中元陽，共為君藥；熟地黃滋補腎精，山茱萸肉、山藥養肝補脾，俱為臣藥；淫羊藿、透骨草益腎強骨，兩藥合用，助君藥溫壯腎陽之功；諸藥合用，補腎之中兼顧養肝益脾，使腎精得充而虛損易復；溫陽之中參以滋陰填精，則陽得陰助而生化無窮，諸藥合用，共奏補腎助陽、益精填髓之效，但作用機制尚未清楚。

本研究通過篩選“陰陽雙補方”主要有效成分，并構建其與相關靶點相互作用網絡圖，發現β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素及淫羊藿苷等為其核心化合物。其中β-谷甾醇一方面可通過清除活性氧誘導結腸癌細胞凋亡，另一方面可抑制人結腸癌細胞中β-連環蛋白和PCNA抗原的表達，進而抑制癌細胞生長[7]。山柰酚可抑制中性粒細胞釋放中性粒細胞胞外陷阱，進而抑制癌細胞轉移，此外也可激活MAPK信號和MMP信號[8]。槲皮素可抑制甲狀旁腺激素受體1活性，阻礙其與甲狀旁腺激素和甲狀旁腺激素相關肽的結合，進而降低人轉移性骨肉瘤細胞的侵襲、黏附、增殖和遷移率[9]。淫羊藿苷具有抑制血管生成和腫瘤轉移的作用，其作用機制主要是通過降低肝癌細胞中VEGF和APRIL的表達水平以抑制內皮細胞遷移[10]。

通過Cytoscape3.8.2軟件構建“陰陽雙補方”治療骨轉移癌的功能關聯網絡，發現EGFR、CASP3、STAT3、AKT1、ERBB2及MMP2/9。其中EGFR在促進多種腫瘤的發生和轉移中有重要作用，研究認為可溶性因子可通過旁分泌機制激活鄰近成骨細胞中的EGFR通路，并下調OPG表達，RANKL和OPG比例增加有利于破骨細胞的生成，并導致溶骨性骨轉移的惡性循環[11]。CASP3通常被認為是細胞凋亡的標志，其活性增加可促進應激誘導的癌細胞生長、細胞遷移、侵襲性和腫瘤血管生成[12]。STAT3是一種轉錄因子，通過JAK-STAT3信號通路在腫瘤細胞增殖、存活、侵襲和免疫抑制中有重要作用，還可通過炎癥、干細胞和轉移前生態位促進癌癥發生[13]。ERBB2可在癌癥干細胞中選擇性表達，并且在脛骨中的表達水平更高，這可能是通過RANKL激活RANK受體介導的[14]。AKT1基因是原癌基因，其相應的蛋白質可調節PI3K信號轉導途徑下游的事件，并在抑制細胞活力、增殖、分化和凋亡中起重要作用[15]。MMP2/9均為癌相關性內肽酶，在調節細胞生長、侵襲、遷移、血管生成和炎癥的一些關鍵信號通路中發揮關鍵作用[16]。

通過DAVID數據庫富集分析發現，陰陽雙補方治療骨轉移癌的作用機制主要涉及抑制癌細胞轉移、促細胞凋亡及調節骨微環境等多個環節。其中HIF信號通路是腫瘤微環境的重要組成部分，當局部缺氧和成骨細胞中缺氧時HIF-1α可被激活，這對維持骨骼內環境平衡至關重要[17]。研究發現骨祖細胞位于骨髓中的低氧環境中，當骨祖細胞中HIF信號激活可增加趨化因子CXCL12的血液水平，進而直接激活CXCR4受體導致乳腺癌細胞增殖和擴散的系統性增加[18]。Rap1信號傳導涉及不同癌癥細胞增殖和遷移的調節，研究顯示Rap1GAP的逆轉錄病毒沉默可極大程度增強ERK/MAPK的磷酸化和活化，誘導廣泛的細胞骨架重組和EMT特征的表達，并增強乳腺導管原位癌細胞的侵襲[19]。VEGF可通過結合內皮細胞上的VEGFR1/2影響腫瘤微環境，其旁分泌機制大大增加了腫瘤血管的數量和大小，以提供充足的血液供應[20]。研究發現在各種腫瘤組織中，VEGF通過自分泌作用與分泌VEGF的腫瘤細胞上的VEGF受體結合，這種分泌反應導致不同信號轉導途徑的激活，并最終支持腫瘤的生長和增殖[21]。PI3K/Akt通路中相關蛋白表達可影響胃癌細胞轉移及侵襲能力，可能用于預測患者術后骨轉移的發生[22]。mTOR是PI3K/Akt通路下游的一個蛋白，在該通路活化后可增加磷酸化產物水平，進而介導下游重要信號分子，促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲過程，抑制凋亡[23]。

綜上所述，從網絡藥理學角度分析可發現，陰陽雙補方主要有效成分如：β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素及淫羊藿苷等可通過EGFR、CASP3、STAT3、AKT1、ERBB2及MMP2/9等靶點調控HIF-1、Rap1、VEGF、PI3K-Akt及mTOR等信號通路，進而發揮抑制癌細胞轉移、促凋亡及調節骨微環境等作用，這對未來臨床用藥及本團隊后期基礎研究方向都有一定參考價值。