基于毒效成分含量的正交試驗優(yōu)選蒼耳子炮制工藝

黃保生，黃成，韓燕全*，朋湯義*，金傳山，吳德玲

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 中藥復(fù)方安徽省重點實驗室,現(xiàn)代藥物制劑安徽省工程技術(shù)中心，安徽 合肥 230031)

蒼耳子為菊科植物蒼耳XanthiumsibiricumPatr.的干燥成熟帶總苞的果實，為臨床常用中藥。蒼耳子性味辛、苦、溫，有毒，具有散風(fēng)寒、通鼻竅[1]、祛風(fēng)濕、止痛、解毒殺蟲的功效。主治風(fēng)寒感冒、頭疼鼻塞、鼻淵流涕、風(fēng)疹瘙癢、風(fēng)寒濕痹及肢體拘攣等[2]。蒼耳子為傳統(tǒng)中藥，化學(xué)成分復(fù)雜，主要含苷類、揮發(fā)油類、脂肪油類、有機(jī)酸類、木脂素類、雜環(huán)類、黃酮類、蒽醌類、倍半萜內(nèi)酯類等,具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗過敏、降血脂、降血糖、抗癌等藥理作用[3-5]。

研究表明，蒼耳子中含有大量的酚酸類成分，具有良好的抗氧化、抗炎的作用，可抑制血小板凝集活性，是蒼耳子發(fā)揮臨床療效的重要組分[6]。綠原酸作為蒼耳子內(nèi)含量最多的一類酚酸類成分，2020年版《中國藥典》規(guī)定，其含量測定不得少于0.25%，以綠原酸為主的酚酸類成分被認(rèn)為是主要抗炎鎮(zhèn)痛活性成分。除綠原酸外，隱綠原酸、3，4-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡酰奎寧酸等咖啡酸衍生物也被推測為蒼耳子抗炎鎮(zhèn)痛的活性成分。蒼耳子生品有毒，據(jù)報道羧基蒼術(shù)苷、蒼術(shù)苷和4’-去磺基蒼術(shù)苷[7]為其主要毒性成分，此外蒼耳子植物蛋白[8]被認(rèn)為是其毒性成分之一。因此將綠原酸、隱綠原酸、3，4-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡酰奎寧酸這4種酚酸作為有效成分指標(biāo)，結(jié)合毒性成分蛋白質(zhì)做正交試驗以優(yōu)選其炮制最佳工藝。

對蒼耳子及其炮制品的主要化學(xué)成分、藥理作用等研究已有一定進(jìn)展，但針對蒼耳子及其炮制品的毒效結(jié)合研究還不夠全面。本文在分析總結(jié)目前已有研究的基礎(chǔ)上，運(yùn)用UPLC法計算有效成分含量、BCA法計算蛋白質(zhì)含量，采用正交法，優(yōu)選蒼耳子炮制工藝，以期為基于毒效成分優(yōu)選蒼耳子的炮制工藝提供借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超高效液相色譜儀(Waters-Acquity，美國Waters公司);全波長酶標(biāo)儀(1510型，Thermo Fisher Scienti-fic Oy Ratastie 2.FI-01620BVantaa.Fintand)；BS200S型十萬分之一電子天平；KQ-300DE超聲波清洗儀；KDC-16H離心機(jī)；DK-S24電熱恒溫水浴鍋；SX-610pH計；XFB-200高速中藥粉碎機(jī)。

1.2 試劑與藥品

蒼耳子購于安徽省亳州市滬譙藥業(yè)有限公司(1911160062)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院李立華主任鑒定為菊科植物蒼耳XanthiumsibiricumPatr.的成熟帶種苞的果實。對照品：綠原酸(DST180504-21)、隱綠原酸(MUST-11112203)、3，4-二咖啡酰奎寧酸(MUST-12041114)、4，5-二咖啡酰奎寧酸(MUST-11081803)均為成都曼思特生物科技有限公司生產(chǎn)；甲醇(20190905)和乙腈(75-05-8)為色譜純；磷酸(101217)和石油醚(20190929)為分析純；蒸餾水為屈臣氏水(20190524)；BCA蛋白定量試劑盒(R21250-250T，上海源葉生物科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 炒蒼耳子制備

稱取干凈的蒼耳子藥材20 g，篩選除去雜質(zhì)后，放入炒制容器內(nèi)，加入15倍量砂，炒制一定時間后，迅速過篩、晾涼，粉碎待用。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件

Waters Acquity BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm) ；流動相為乙腈(A)和0. 1% 磷酸溶液(C),流速：0.25 mL/min,進(jìn)樣量：1 μL，柱溫：30 ℃，檢測波長327 nm[9]。梯度洗脫程序：0～2.5 min，3%～10%A；2.5～8.5 min，10%～15%A；8.5～14 min，15%～25%A；14～16 min，25%～40%A；16～18 min，40%～3%A；18～20 min，3%A。在該色譜條件下，炒蒼耳子與混合對照品色譜圖見圖1。

在此色譜條件下，蒼耳子中這4種酚酸成分峰形穩(wěn)定，對各成分進(jìn)行精密度試驗，記錄各成分峰面積，其峰面積RSD值介于0.075%～0.390%之間，說明該色譜條件穩(wěn)定可行。

2.2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密吸取4種酚酸對照品溶液，加色譜醇甲醇定容，制成每1 mL分別含有90.60 μg綠原酸、15.15 μg隱綠原酸、2.06 μg 3,4-二咖啡酰奎寧酸以及1.12 μg 4,5-二咖啡酰奎寧酸混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取蒼耳子粉末0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇(分析純)10 mL，密封，稱重，超聲處理(功率300 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇(同種分析純)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.22 μm濾膜過濾于棕色瓶，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對照品溶液0.5，1，2，3，4，5 μL，按“2.2.1”項色譜條件進(jìn)樣，記錄4種酚酸的峰面積。以各參比濃度(μg/mL)為X坐標(biāo)，以峰面積為Y坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程見表1。

表1 4種成分的線性回歸方程

2.2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液1 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄4種酚酸的峰面積，計算RSD(%)值，結(jié)果RSD(%)在0.075～0.390之間，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

分別精密吸取同一炒蒼耳子供試品溶液1 μL，按“2.2.1”項方法分別于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣，記錄4種酚酸的峰面積，計算RSD(%)值，結(jié)果RSD(%)在0.110～0.630之間，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗

取同一炒蒼耳子5份，按“2.2.3”項下制備供試品溶液，精密吸取1 μL。樣品在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣，記錄4種酚酸的峰面積，計算其含量，計算得其RSD(%)值0.032～0.095之間，表明該樣品處理方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.8 加樣回收率試驗

按“2.1”項制備方法，制備炒蒼耳子，取已知含量的炒蒼耳子6份，按照“2.2.3”項下制備樣品溶液6份，每份取0.5 mL，分別加入樣品中成分含量接近的對照品，混合均勻，用0.2 μm濾膜過濾，按“2.2.1”項方法進(jìn)樣，結(jié)果4種成分的平均加樣回收率在95%～105%之間，RSD(%)在0.100～0.300之間。

2.2.9 蛋白質(zhì)含量測定

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，蒼耳子蛋白質(zhì)最佳提取條件如下，液料比∶粉末∶蒸餾水=1∶1∶2；提取pH=10；提取溫度：90 ℃；提取時間：50 min。

取蒼耳子粉末3 g，80 ℃水浴溫度下，用石油醚對其進(jìn)行脫脂處理4 h，粉末晾干備用。取上述粉末0.5 g，按液料比為12，加6 mL純水溶解，用1 mol/LNaOH溶液調(diào)溶液pH值為10，50 ℃超聲提取90 min，采用堿提法提取蛋白。

提取后樣品取上清液，6 000 r/min,離心15 min，再次取上清，稀釋100倍后，根據(jù)對照品牛血清蛋白濃度成梯度繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，用BCA法測定蛋白質(zhì)562 nm下吸光度值，進(jìn)而得樣品蛋白質(zhì)含量。

各單因素試驗結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2～6。

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

2.4 正交試驗設(shè)計

以炒制溫度(A)和炒制時間(B)為考察因素，每個因素選擇4個水平，以蒼耳子4種成分和蛋白質(zhì)含量為綜合評分指標(biāo)。采用多指標(biāo)正交試驗法，優(yōu)化蒼耳子炒制工藝，因素水平表見表2。

表2 因素水平表

2.5 正交試驗結(jié)果

按照正交表進(jìn)行正交試驗，按照“2.2.3”項下制備供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，得出4種酚酸峰面積及含量。按照“2.3”項下方法計算蒼耳子各成分的綜合評分值。采用綜合加權(quán)評分法，優(yōu)化蒼耳子炒制工藝。正交試驗結(jié)果見表3。

表3 試驗設(shè)計與結(jié)果

從表3結(jié)果可見，通過綜合評分法，溫度因素的極差很大，時間因素極差相對較小。根據(jù)正交試驗的結(jié)果，確定蒼耳子的最佳炒制工藝為炒制溫度150 ℃，炒制時間8 min。

2.6 驗證試驗

根據(jù)優(yōu)選出的蒼耳子炒制工藝制備3組炒蒼耳子。對每組樣品4種指標(biāo)成分和蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，將各成分含量計算平均值后，與生品含量做對比，與生品變化率情況，結(jié)果如表4所示。

表4 最佳工藝結(jié)果驗證

3 討論

實驗考察了色譜柱、柱溫、波長、進(jìn)樣量、流速和流動相等對色譜峰分離度的影響，色譜柱為Waters Acquity BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)波長為327 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，流速為0.25 mL/min，流動相為0.1%磷酸-乙腈。此條件下，圖譜基線平穩(wěn)，分離度好。本實驗選擇的檢測方法可靠穩(wěn)定。

蒼耳子屬解表中藥，其味甘，性溫，歸肺經(jīng)，善發(fā)汗，上通腦頂，下行足膝，外達(dá)皮膚，可發(fā)散風(fēng)寒、祛風(fēng)濕、止痛、通鼻竅，是歷代治療鼻淵頭痛之要藥[10]。常用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急慢性鼻炎、過敏性鼻炎、皮膚病等免疫系統(tǒng)異常相關(guān)疾病，具有較高的藥用價值。此外，毒理學(xué)研究表明，蒼耳子具有肝臟、腎臟、心臟、胃腸道毒性等不良反應(yīng),尤其是肝損傷[11]后會出現(xiàn)黃疸和因心損傷后會出現(xiàn)心律不齊等癥狀[12],其毒性作用機(jī)制現(xiàn)在認(rèn)為主要與其含有的蛋白質(zhì)類成分密切相關(guān)。作為一味毒效并存的中藥，蒼耳子因使用不當(dāng)也易引起一系列安全問題。

經(jīng)現(xiàn)代研究表明，適當(dāng)加熱能提高蒼耳子中綠原酸的含量[13]，陳健明等[14]研究表明蒼耳子炮制去刺有助于提升鎮(zhèn)痛作用，臨床常通過炮制降低其毒性[15]。更多還原本實驗研究表明，蒼耳子炒制后，有效成分含量有所升高，毒性蛋白含量降低。在此基礎(chǔ)上，本實驗以蒼耳子炒制溫度及炒制時間為考察因素，4種酚酸有效成分及蛋白質(zhì)含量為評價指標(biāo)，通過正交試驗，優(yōu)選出蒼耳子最佳炮制工藝為150 ℃，炒制8 min。同時對工藝進(jìn)行驗證，得到3組驗證試驗結(jié)果較生品含量比較變化率，得出結(jié)論，炮制品含量較生品而言，綠原酸含量上升50.121%；隱綠原酸含量上升7.817%；3，4-二咖啡酰奎寧酸含量下降57.237%；4，5-二咖啡酰奎寧酸含量上升126.996%；蛋白質(zhì)含量較生品下降11.552%。結(jié)果表明，蒼耳子炮制后酚酸類有效成分含量較生品整體上升，部分成分含量下降，可能與加熱后酚酸類結(jié)構(gòu)變化情況有關(guān)，因此“增效”現(xiàn)象還存在不足之處；毒性蛋白含量較生品降低。

毒性蛋白提取分離方法有待改進(jìn)，以毒性蛋白指標(biāo)作為其“減毒”的論點較為單一，可結(jié)合蒼術(shù)苷、羧基蒼術(shù)苷等其他毒性成分做進(jìn)一步研究。此外，本實驗僅僅從含量變化入手，還需要結(jié)合藥效實驗做更深入的探討，以得出蒼耳子炮制“減毒增效”的確切作用機(jī)制。