玉米須提取物對小鼠糖尿病足模型的炎癥干預作用研究

孫秋，閆禹竹，王海英，王俊志*

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱市第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150056)

糖尿病的各種血管疾病并發癥中，以動脈硬化性閉塞病癥最為嚴重[1]，糖尿病的周圍動脈硬化發展快、程度高[2]，后果嚴重，一旦發生壞疽，其截肢率是不患糖尿病患者的40倍。糖尿病性動脈硬化閉塞癥初始表現為缺血，繼而由于足應力、外傷等因素出現感染和神經病變，形成嚴重下肢病變即為糖尿病足(Diabetic Foot，DF)，最終可致肢體截肢，有統計顯示一側截肢的患者，三年后約有將近1/3需再行對側肢體截肢[3]。玉米須是我國歷史悠久的中藥材，夏、秋玉米果實成熟時收集后除去雜質，鮮用或曬干生用，《中藥學》教材記載其甘淡滲泄、功專利水滲濕消腫，藥性平和、能利濕而退黃，故陰黃陽黃均可應用[4]。現代藥理表明玉米須含有揮發油、脂肪油、樹脂、生物堿、皂苷、檸檬酸等[5]，具有較強的抑菌、利尿、降壓、降糖、降脂、增強機體免疫力等作用。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級昆明種小鼠150只，體質量(24.0±3.0)g，購自黑龍江中醫藥大學動物實驗中心，實驗動物使用許可證號為SYXK(黑)2013-012。實驗飼養溫度和相對濕度分別為20～26 ℃、40%～70%，實驗開始前所有小鼠常規飼養，自由飲水[6]。

1.2 藥物與試劑

鏈脲佐菌素(STZ)、檸檬酸購自西格瑪公司；血糖儀和血糖試紙購自羅氏診斷公司。白細胞介素-1(IL-1)、超敏反應蛋白(hs-CRP)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)試劑盒由武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司提供。

1.3 儀器

超聲波粉碎機(上海凈信，XM-650T)；水浴恒溫振蕩器(精達儀器，HZS-HA)；超低溫冰箱(博科，BDF-86V398)；電子天平(德國Sartorius，BSA224S)；高速離心機(中國Anke，TGL-20B)；全自動酶標儀(賽默飛世爾，Multiskan FC)[6]。

2 方法

2.1 玉米須提取方法

將0.2 kg干燥玉米須用超聲波粉碎機粉碎，將玉米須融入50 ℃的1.5 L蒸餾水中使用水浴恒溫振蕩器提取2遍，濾渣后收集玉米須濾液，濾液放置高速離心機內離心后留取上清液，水浴80 ℃濃縮后置真空干燥器內至水分干燥完全，得到玉米須濃縮水溶性提取物，密封至-80 ℃超低溫冰箱存儲備用。使用時，以蒸餾水溶解提取物即得玉米須提取物水溶液[6-7]。

2.2 實驗動物造模

小鼠適應性喂養1周，隨后150只小鼠隨機分成5組，分別為空白對照組，模型對照組，玉米須提取液高、中、低劑量組，每組30只。空白對照組繼續進行基礎標準飼料喂養，模型對照組及玉米須提取液高、中、低劑量組給予高脂高糖飲食飼料喂養。除空白對照組外，其余4組在第12周使用鏈脲佐菌素(STZ)進行DF模型造模，開始造模前12 h小鼠禁食但可自由飲水，將STZ放入到pH值為4.2檸檬酸(濃度為0.1 mmol/L)溶解，之后的5 d按照40 mg·kg-1·d-1劑量給造模小鼠行腹腔注射，造模成功標準為小鼠空腹6 h血糖值>11.1 mmol/L[6-7]。

2.3 給藥方法

玉米須提取物不同劑量組按照高劑量組400 mg/kg、中劑量組200 mg/kg、低劑量組100 mg/kg，分別配置治療液濃度為20 g/L、10 g/L、5 g/L，按照0.02 mL/g標準灌胃，空白及模型對照組給予等體積生理鹽水，持續用藥30 d，第30天給藥后1 h，禁食12 h后行尾部采血指標檢測[6-7]。

2.4 檢測指標

觀察小鼠用藥前后的血糖、炎癥因子白細胞介素-1(IL-1)、超敏反應蛋白(hs-CRP)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)、細胞間牲附分子-1(ICAM-1)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的指標含量變化。

2.5 數據處理

3 結果

3.1 小鼠DF模型成功標準

給藥前各造模組血糖值均>11.1 mmol/L表示造模成功，同空白對照組相比較，差異有統計學意義(P<0.01)，課題組前期已發表過關于血糖對比情況文章，此處不再贅述[6-8]。

3.2 玉米須提取液對DF小鼠IL-1、hs-CRP炎癥因子影響

根據表1可知，給藥前空白對照組與各造模組IL-1、hs-CRP炎癥因子比較有明顯差異(P<0.01)。給藥后玉米須提取物高、中、低劑量組與模型對照組相比，均具降低IL-1、hs-CRP炎癥因子的作用(P<0.01)，且呈現玉米須提取物劑量濃度依賴性，玉米須提取物高劑量組要明顯優于低劑量組(P<0.05)。

表1 玉米須提取液對DF小鼠IL-1、hs-CRP炎癥因子影響

3.3 玉米須提取液對DF小鼠VCAM-1、ICAM-1、MCP-1的影響

根據表2可知，用藥前空白對照組與各造模組VCAM-1、ICAM-1、MCP-1因子比較有明顯差異(P<0.01)。給藥后玉米須提取物高、中、低劑量組與模型對照組相比均具降低VCAM-1、ICAM-1、MCP-1的作用(P<0.01)，且呈現玉米須提取物劑量濃度依賴性，玉米須提取物高劑量組要明顯優于低劑量組，組間對比，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 玉米須提取液對DF小鼠VCAM-1、ICAM-1、MCP-1影響

4 討論

糖尿病足是糖尿病神經病變和血管病變引發的合并癥，進而引起肢體感染、潰瘍、壞疽形成，甚至可導致深層組織破壞終致截肢[9]。血管病變在糖尿病足的發生、發展、預后等方面起著至關重要的作用[10]，血管的炎癥反應是糖尿病血管并發癥的始發和促動因素，其參與整個血管病變的全程[11]。越來越多的研究表明，糖尿病足不僅是高血糖的疾病，也是一種炎癥反應性疾病，炎癥因子在糖尿病足及其并發癥的發生、發展、演變中起到媒介作用[12]。在糖尿病足的發病過程中，會激發一系列的炎癥反應，內皮細胞激活導致黏附分子表達，如VCAM-1、ICAM-1因子，吸引炎性細胞因子如單核細胞、中性粒細胞等到達較早期的損傷部位[13]。細胞內炎性信號通路在動脈粥樣硬化斑塊中的免疫細胞、內皮細胞和平滑肌細胞等多類型細胞內激活及表達起到至關重要的作用，各類細胞受其調節分泌黏附分子(如VCAM-1、ICAM-1等)，趨化因子(如MCP-1)，促炎性細胞因子(如IL-1β、IL-6等)釋放，參與糖尿病性動脈粥樣硬化斑塊的進展[13]。hs-CRP作為一種炎癥性刺激時的急性相蛋白，其在機體受到微生物入侵或組織損傷等情況下由肝細胞合成，是動脈硬化性血管疾病的獨立危險因子，是血管并發癥的預測因素，其水平的升高與血管并發癥有顯著的相關性[14]。IL-1作為一種敏感的炎性急性期指標，介導內皮細胞同白細胞之間的黏附，參與血管機能調節，促進血管平滑肌不同程度地增生、增加血管內膜通透性，同時可誘導纖溶抑制因子和凝血系統激活因子基因表達，誘導炎癥因子中性粒細胞向血管內皮下移行[13]。

中醫認為糖尿病足屬于“消渴”“脫疽”范疇，病因病機為正虛、血瘀、毒聚，虛以氣虛、陰虛為主，實以氣滯血瘀、濕熱壅盛為主，日久內阻氣機，氣血不生，外蘊肌膚，壅滯經絡，氣血不通至肢體失養。當以補虛化瘀、解毒通絡為治療大法[15]。古代醫學關于本病的記載極為豐富，宋代《圣濟總錄》中有很多關于“消渴”癥狀的描述，如“飲水不輟，飲食過人而不覺飽”等，同時還指出“能食而渴者必發腦癰，背癰”，元代羅天益《衛生寶鑒》曰：“足發惡瘡，至死不救”。把發生于肢體末端的癰疽，歸屬于“脫疽”，這些描述說明古代醫家已經認識到糖尿病可以并發肢體壞疽，并且對其有了深刻的研究[1，16]，本病嚴重影響患者的基本生活質量并給患者帶來沉重的經濟負擔和長期的精神痛苦[7]。

本實驗研究發現，與模型對照組比較，經玉米須提取液給藥后，高、中、低劑量組與DF小鼠模型相比較均具有降低IL-1、hs-CRP的作用(P<0.01)，且呈現玉米須提取物劑量濃度依賴性，高劑量治療組要明顯優于低劑量治療組降低IL-1、hs-CRP的作用，治療組間差異有統計學意義(P<0.05)。給藥后玉米須提取物高、中、低劑量組與DF小鼠模型對照組相比均具降低VCAM-1、ICAM-1、MCP-1的作用(P<0.01)，且呈現玉米須提取物劑量濃度依賴性，高劑量治療組要明顯優于低劑量治療組降低VCAM-1、ICAM-1、MCP-1的作用，治療組間差異有統計學意義(P<0.05)。

綜上所述，糖尿病足的病理主要與糖代謝異常、炎癥因子的反應相關，玉米須提取液可不同程度地降低FBG、IL-1、hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1，改善小鼠的炎癥狀態，尤其是高劑量組的各項指標改善最為明顯。本研究結果提示，炎癥因子和炎癥反應參與糖尿病足的病理過程，玉米須提取液可以降低血糖、抑制炎癥因子的釋放，改善血管炎癥狀態，有利于糖尿病足的恢復。通過此項研究期望可以通過玉米須這種最普通的、藥食同源的藥物得到更多的啟發，降低糖尿病足的治療成本，發揮更好的社會經濟效應，為北藥開發提供一定的力量。