食品中亞硝酸鹽測定發現的問題及其研究探討

郝景雯，張宗煜,2,3,4,5，劉 然,2,3,4,5

(1. 天津市工業微生物研究所有限公司 天津 300462；2. 天津量信檢驗認證技術有限公司 天津 300462；3. 天津實發中科百奧工業生物技術有限公司 天津 300462；4. 天津市工業微生物企業重點實驗室 天津 300462；5. 天津市工業微生物工程技術中心 天津300462)

0 引 言

亞硝酸鹽是一類含氮無機化合物的總稱，我們所說的亞硝酸鹽一般指的是亞硝酸鈉。亞硝酸鈉為白色或淡黃色粉末，有時也呈顆粒狀，易溶于水。食品生產中亞硝酸鹽主要作為發色劑和防腐劑來使用。我國對食品中亞硝酸鹽含量的最大使用量和最大殘留限量進行了規定，并建立了多種檢測亞硝酸鹽的方法。測定亞硝酸鹽的含量是食品安全檢測中非常重要的項目。本文主要對 GB5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》的第二法分光光度法發生的實驗現象進行了研究討論。

1 食品中的亞硝酸鹽

1.1 食品中亞硝酸鹽的來源

食品中亞硝酸鹽的來源，一是由于加工的需要而添加，二是施肥過度由土壤轉移到植物源食物中。亞硝酸鹽可以抑制梭狀芽孢桿菌及形成的肉毒桿菌，以前常用作防腐劑，現已不常見。造成腌熏制品中亞硝酸鹽含量較高的原因除直接添加外，還與植物源腌制品中硝酸鹽在硝酸還原酶的作用下轉化為亞硝酸鹽有關。植物源食物原料沾染的部分微生物能分泌具有高活性的硝酸還原酶，影響硝酸還原酶活性的因素較多，包括食鹽濃度、酸度、糖度、發酵溫度、氧氣含量、微生物污染等[1]。

1.2 硝酸鹽、亞硝酸鹽及N-亞硝基化合物的性質

硝酸鹽在哺乳動物體內可轉化成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽可與胺類(脂肪族或芳香族仲胺，見圖1)、氨基化合物及氨基酸等形成 N-亞硝基類化合物。亞硝酸鹽既有氧化性，又有還原性，以氧化性為主[2-3]。

圖1 亞硝酸鹽在酸性條件與仲胺生成亞硝胺Fig.1 Formation of nitrosamines from nitrite and secondary amines in acid condition

1.3 硝酸鹽、亞硝酸鹽及N-亞硝基化合物的毒性

硝酸鹽一般是低毒的，但亞硝酸鹽及 N-亞硝基類化合物對哺乳動物有一定的毒性。對普通的兔、豬、鼠及懷孕的豬、羊進行食物中添加后的喂食試驗結果顯示硝酸鹽對生殖能力影響的數據尚不能確定，在本質上沒有基因毒性。亞硝酸鹽雖有基因毒性，但對嚙齒動物試驗表明，連續2年大鼠按每天每千克體重攝入 6.7mg的亞硝酸根離子無副作用。亞硝酸鹽能引起高鐵血紅蛋白的累積，當高鐵血紅蛋白超過10%時會產生毒性。N-亞硝基化合物有強烈的致癌性。亞硝酸鹽攝入過多對人體造成的最初癥狀是頭暈、頭痛、視物不清、全身無力、反應遲鈍，繼而出現心悸、惡心、嘔吐、腹痛等癥狀。

1.4 食品中的限量要求

GB 2762—2017對硝酸鹽、亞硝酸鹽及 N-亞硝基化合物在食品中的限量提出了要求。可能是由于三者的毒性差別較大，對硝酸鹽、亞硝酸鹽的限量都是 mg/kg(10-6，ppm)級，且對硝酸鹽的限量比亞硝酸鹽的限量高，對 N-二甲基亞硝胺的限量則是 μg/kg(10-9，ppb)級[4]。

2 實驗討論

2.1 實驗現象的發現

本文主要對 GB5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》的第二法分光光度法發生的實驗現象進行了研究討論。根據GB5009.33—2016第二法測定亞硝酸鹽，涉及到的反應原理是在鹽酸溶液中對氨基苯磺酸和亞硝酸鈉先反應生成重氮鹽，再與鹽酸萘乙二胺發生偶合反應，進而生成紫紅色物質，在 538nm比色，用外標法確定含量[5]，見圖 2、3。

圖2 重氮鹽的生成Fig.2 Formation of diazonium salt

由圖 3可以看出該反應是芳香胺和重氮鹽發生的偶合反應，產物中偶氮基團(—N＝N—)在萘環上的位置是根據萘環上的氨基定位規則推測出來的，但因實驗室沒有分離提純及結構鑒定相關儀器設備，故無法確定是否正確。根據國標中的原理部分(GB5009.33—2016第 9部分)及有機化學反應相關理論，該反應需要在弱酸性溶液中進行。因為強酸性溶液會使萘環上的乙二胺基團變成銨鹽，銨鹽將使萘環的反應活性降低，而不能發生偶合反應。但在實驗觀察過程中，通過監控反應體系的 pH值，我們發現對氨基苯磺酸和亞硝酸鈉生成重氮鹽的反應體系呈強酸性，用pH試紙檢測pH＝1～2，偶合后的反應體系仍然呈強酸性，用pH試紙檢測pH＝1～2，這個現象與國標對反應原理的介紹和有機化學理論不相符。因此，實驗過后我們對該反應體系進行了研究討論。

圖3 偶合反應Fig.3 Coupling reaction

2.2 調酸堿實驗

將無色的重氮鹽溶液和無色的鹽酸萘乙二胺溶液混合在一起，生成了紫紅色溶液，可以判斷 2種溶液必然發生了反應，只是由于反應條件、國標中的原理和有機化學理論不相符，無法確定發生的是否為偶合反應。為了將反應體系調成弱酸性，我們向其中緩慢加入氫氧化鈉溶液，在這個過程中，紫紅色逐漸變淺，最終呈無色，此時已經呈強堿性。因不清楚在這個過程中是發生了其他反應，還是僅僅發生了“偶氮指示劑變色”現象，又向其中加入了過量的“20%鹽酸(按照 GB 5009.33—2016中 10.2.8配制)”調至強酸性，紫紅色再次出現，此時用 pH 試紙檢測 pH＝1～2。我們對鹽酸萘乙二胺溶液、對氨基苯磺酸溶液也進行了同樣的調 pH試驗，未發現變色現象，2種溶液始終保持無色。

2.3 試驗結果分析

根據以上試驗現象可以推測出，按照GB5009.33—2016操作，對氨基苯磺酸和亞硝酸鈉先反應生成重氮鹽，再與鹽酸萘乙二胺混合，所發生的應該是偶合反應。原因之一是產物呈紫紅色，在偶氮化合物中，芳香環通過偶氮基相連形成一大的共軛體系，π電子有較大的離域范圍，可吸收可見光波長范圍的光，因而顯現顏色[6]。第二個原因是產物顏色隨 pH而變化，該現象與部分偶氮化合物相同。如甲基橙即為偶氮化合物，它在酸堿溶液中結構發生變化而顯示不同顏色，故被用作酸堿指示劑。由前述實驗現象可以看出，該“指示劑”在堿性條件下無色，在酸性條件下呈紫紅色。我們根據同樣為偶氮指示劑的甲基橙的變色原理[7]推測了反應產物的變色原理，見圖 4。

圖4 可能的變色原理Fig.4 Possible discoloration principle

根據以上現象，我們進一步分析認為，該偶合反應能在強酸性條件下進行，反應條件、國標中的介紹和有機化學理論不相符，原因可能是鹽酸沒有和直接連在萘環上的仲胺(NH)成鹽，而是和距離萘環比較遠的伯胺(NH2)成鹽，因此對萘環的反應活性幾乎沒有影響，見圖5、圖6。

圖5 鹽酸和仲胺成鹽，萘環反應活性降低Fig.5 Decrease in reaction activity of naphthalene ring during salt formation using hydrochloric acid and secondary amine

圖6 鹽酸和伯胺成鹽，萘環反應活性基本不變Fig.6 Unchanged reaction activity of naphthalenering during salt formation using hydrochloric acid and primary amine

3 討論與展望

由于本試驗未進行分離提純及結構鑒定等實驗步驟，無法驗證GB 5009.33—2016的產物(即圖3中的產物)結構是否正確，但可以進行推論：對氨基苯磺酸和亞硝酸鈉生成重氮鹽，再與鹽酸萘乙二胺發生偶合反應，其產物是一種偶氮指示劑，而且未在目前化學試劑銷售的相關網站上找到匹配的相應物質成品。后續應該將該產物進行分離提純，并通過核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、X射線衍射等技術手段進行結構鑒定(包括但不限于以下 2方面：①產物是否為偶氮化合物；②如果產物是偶氮化合物，在萘環上的取代位置是否正確)，以確定其變色原理，也有可能使其發展成為一種新型的化學指示劑。

為進一步分析討論，又查找了其他測定亞硝酸鹽的檢測標準，發現在 GB/T 5750.5—2006《生活飲用水標準檢驗方法 無機非金屬指標》第 10部分[8]、GB/T 6912—2008《鍋爐用水和冷卻水分析方法 亞硝酸鹽的測定》[9]、GB/T 7493—1987《水質 亞硝酸鹽氮的測定 分光光度法》[10]、GB 8538—2016《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》第 41部分[11]這 4個標準中檢測亞硝酸鹽涉及的反應和GB 5009.33—2016相似，只是把對氨基苯磺酸(p-NH2-C6H4-SO3H)換成了對氨基苯磺酰胺(p-NH2-C6H4-SO2NH2)，如圖7所示。因其偶合產物已經有商品銷售 CAS 13231-94-2，故沒有對這個反應進行實驗。

圖7 GB/T 5750.5—2006、GB/T 6912—2008、GB/T 7493—1987、GB 8538—2016的產物Fig.7 Products of GB/T 5750.5-2006，GB/T 6912-2008，GB/T 7493-1987 and GB 8538-2016

GB/T 5750.5—2006第5部分是檢測硝酸鹽，因5.4部分是先將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，再與對氨基苯磺酰胺、鹽酸萘乙二胺反應，因而可以看作與前述4個標準涉及的反應一樣。在這幾個標準中，產物的顏色不完全相同。根據這幾個標準描述的內容，我們發現其產物很可能也是指示劑，而且影響其顏色的因素很可能比較復雜，現把這5個部分中相關信息歸納如下。

①在GB/T 5750.5—2006第5.4部分中，對氨基苯磺酰胺的配制是將 5g對氨基苯磺酰胺溶于350mL(1+6)鹽酸中，用水稀釋至 500mL。鹽酸萘乙二胺的配制是 0.5g鹽酸萘乙二胺溶于 500mL水中。測定時先將 0.5mL對氨基苯磺酰胺溶液和樣品(可能含有亞硝酸鹽)及亞硝酸鹽標準曲線混合均勻，反應2～8min后再加入0.5mL鹽酸萘乙二胺溶液，產物呈玫瑰紅色。在 5.4.5.3.3后面的注 1中也寫明pH對顯色有影響。

②在 GB/T 5750.5—2006第 10部分中，對氨基苯磺酰胺、鹽酸萘乙二胺的配制和第 5.4部分一致，但測定時的用量不一樣，先將 1mL對氨基苯磺酰胺溶液和樣品(可能含有亞硝酸鹽)及亞硝酸鹽標準曲線混合均勻，反應2～8min后再加入1mL鹽酸萘乙二胺溶液，產物呈紫紅色。

③在GB/T 6912—2008中，亞硝酸鹽的標準貯備液是用水配制，對氨基苯磺酰胺、鹽酸萘乙二胺的配制是將 40g對氨基苯磺酰胺溶于 100mL磷酸與500mL水的混合液中，再加入 2g鹽酸萘乙二胺，用水定容至 1L，該混合液被稱為顯色劑，測定時將樣品(可能含有亞硝酸鹽)及亞硝酸鹽標準曲線與顯色劑混合均勻，反應20min后比色，產物呈粉紅色。

④在GB/T 7493—1987中，亞硝酸鹽的標準貯備溶液是用水配制，配好再加氯仿，顯色劑的配制、亞硝酸鹽標準曲線的梯度、測定過程與《GB/T 6912—2008》一樣，產物呈紅色。

⑤在GB 8538—2016第41部分中，對氨基苯磺酰胺、鹽酸萘乙二胺的配制和亞硝酸鹽測定過程與GB/T 5750.5—2006第10部分一樣，而且這2個標準中亞硝酸鹽標準儲備液、標準使用液的濃度接近，標準曲線的梯度一樣，產物呈紫紅色。

根據上面的介紹由此推斷，影響化合物 13231-94-2(即圖7中化合物)溶液顏色的因素可能包括：①pH值；②對氨基苯磺酰胺、鹽酸萘乙二胺的配制方式(單獨配制、配成混合液)、配制溶劑(稀鹽酸、稀磷酸)及反應時的用量(0.5mL、1mL)；③在亞硝酸鹽標準貯備溶液的配制過程中是否加入了少量氯仿等，即化合物 13231-94-2所在體系的 pH、生成過程、體系中的離子、樣品濃度、水溶液中是否有少量氯仿，這些因素都可能影響到溶液的顏色。