莖瘤芥（榨菜）主要品種SSR分子標記差異性研究

王浩，沈進娟，彭麗莎，管中榮，張召榮，王彬，范永紅

（重慶市渝東南農業科學院，川渝共建中國醬腌菜科技創新重慶市重點實驗室，408000）

莖瘤芥（Brassica junceavar.tumida）是我國獨有的特色蔬菜之一，其特點是莖部膨大并形成瘤狀肉質莖（又名青菜頭），是制作榨菜的原料，具有很高的經濟價值[1]。目前，全國莖瘤芥種植面積20萬hm2左右，主要分布在重慶、浙江、四川、湖南、湖北等14個省市區，其中，以重慶種植和加工規模最大，產品也最為集中[2]。重慶涪陵是“中國榨菜之鄉”，也是全國最大的榨菜生產和加工基地，具有完整的榨菜產業鏈和產業化經營格局。無論是青菜頭種植面積和產量，還是成品榨菜產銷量，均位居全國第一[3]。

但是，莖瘤芥遺傳基礎較狹窄、育種種質貧乏，部分材料存在優異性狀不顯著和現有品種難以滿足多元化市場以及規模化、自動化、智能化產業發展需求。鑒定研究育種材料遺傳背景，可根據親本間遺傳距離有效利用雜種優勢，輔助新品種培育及種質創新，提升品種綜合性狀表現，滿足生產及產業發展的需要，是一種切實有效的途徑。莖瘤芥種質資源的鑒定、評價、分類和遺傳研究，是合理利用種質資源、選配親本、創新材料、提高育種效率的重要基礎[4]。SSR分子標記是近年來發展迅速的一種分子標記技術，具有成熟穩定、快速簡便、可靠性強、重復性高且品種間多態性豐富的特點，被廣泛應用于遺傳多樣性分析[5]。

因此，為進一步鑒定研究莖瘤芥主要品種的差異性，本研究利用9對SSR標記對莖瘤芥品種進行熒光標記檢測，通過構建品種分子身份證和分析品種的遺傳多樣性，為莖瘤芥品種資源的鑒定、親緣關系分析、遺傳基礎研究等工作提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從莖瘤芥國家登記品種中隨機選取在重慶與浙江兩地大面積推廣應用的6個品種作為試驗材料。其中重慶品種有涪雜2號、涪雜5號、永安小葉；浙江品種有甬榨1號、甬榨4號、甬榨5號。2021年9月1日播種，采用穴盤育苗的形式，置于重慶市渝東南農業科學院溫室大棚內進行常規肥水管理。

項目組在前期在SSR標記相關研究工作中，獲得了一批多態性引物（表1），2022年1月選擇其中9對條帶清晰、表現穩定的多態性引物用于樣品擴增，正向引物5'端添加熒光標記，所用引物均由上海思興生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.2 DNA提取與PCR擴增

植株生長到第6片真葉時，取第5片真葉，采用改良CTAB法或使用植物專用DNA提取試劑盒，將每個參試品種的50片第5片真葉混合提取DNA。使用紫外分光光度計檢測樣品DNA質量和濃度，并稀釋至50 ng/μL，-20℃保存備用。

PCR擴增采用2×PCR Mix體系擴增，按照表2進行配制（反應體積20μL）。

PCR反應程序為：95℃變性5 min，1個循環；95℃變性30 s，50℃退 火1 min，72℃延伸2 min，35個循環；60℃退火1 min，72℃延 伸2 min，35個循環；72℃延伸10 min，16℃保存。

表2 PCR擴增反應體系

表3 9對SSR引物標記的擴增結果

1.3 SSR熒光標記毛細管電泳檢測

配制HiDi＋Liz混液（1板量）：HiDi 900μL＋Liz 15μL混勻；按分好的引物組合混panel，每個孔吸取3μL擴增好的樣品，然后加2倍水稀釋；吸取2μL混液到上樣板中，每個孔加9μL HiDi＋Liz混液，95℃解鏈5 min；冷凍10 min，離心1 min。連接毛細管電泳儀ABI3730XL進行電泳分析，待毛細管電泳檢測完畢，利用SSR指紋分析器處理后獲得原始數據。

1.4 分子身份證構建

利用9對條帶清晰、表現穩定的SSR多態性引物對6個莖瘤芥品種樣品進行擴增，獲得參試樣品的指紋數據，再將其轉換為數字代碼，即分子身份證。

轉換方法如下：將每對引物在某一樣品上擴增出的每1種帶型用阿拉伯數字1～9編碼（為保證每1種帶型只占一位數字，當帶型數大于9時，分別用a、b、c代表第10、11、12種帶型，依此類推，無帶用0表示）。按照引物帶型種類由少到多的順序，將每個樣品在9對引物上的擴增帶型編碼串聯起來，即得到每個樣品以9位數字（或字母）表示的分子身份證[6]。

2 結果與分析

2.1 SSR標記毛細管電泳結果

如表3、4所示，6個莖瘤芥品種樣品共篩選到7對SSR多態性引物，檢測到20個等位位點，平均每對引物2.2個等位位點；共擴增得到20個帶型，平均每對引物2.2個，擴增片段長度在126～397 bp（其中S5、S7在6個樣本中的帶型表現一致，無多態性）。

表4 9對SSR引物的擴增帶型

表5 供試品種的分子身份證編碼

莖瘤芥為異源四倍體植物（AABB），共36條染色體（2n=36）。測序結果顯示7對SSR引物標記分別位于莖瘤芥6條不同染色體上，且A、B染色體分布相當（表3）。

綜上所述，SSR引物多態性良好，在莖瘤芥染色體中分布較均勻。

2.2 供試品種的分子身份證構建

按照表4所示的引物順序，將每對引物在不同樣品上擴增得到的帶型排列并將其編碼進行串聯，即得到6個莖瘤芥主要品種的分子身份證（表5）。對應位置編碼相同則表明該引物在不同樣品上獲得了相同的擴增條帶。結果表明，6個參試的莖瘤芥主要品種的分子身份證代碼各有差異。通過構建分子身份證代碼，將供試的6個莖瘤芥主要品種進行了合理區分。

對構建好的莖瘤芥品種的身份代碼比對分析發現，6個莖瘤芥品種間平均差異位點3.7個，其中浙江本地品種間平均差異位點5.3個，浙渝兩地品種間平均差異位點4.0個，重慶本地品種間平均差異位點1.3個。

3 結論與討論

3.1 結論

①通過對樣本擴增條帶分析，從9對SSR蕓薹作物公共引物中篩選到7對多態性引物，并且在莖瘤芥染色體中分布較均勻。6個莖瘤芥品種中共檢測到20個等位位點，平均每對引物2.2個；共擴增得到20個帶型，平均每對引物2.2個，擴增片段長度在126～397 bp。引物S5、S7、S12、S16、S39、S20均表現為純合位點；引物S50、S15既有純合位點，又有雜合位點；引物S49均表現為雜合位點。其中引物S5、S7無多態性，后期仍需增加更多品種或榨菜種質資源進一步驗證分析。

②本研究利用SSR熒光標記毛細管電泳檢測技術構建了6個莖瘤芥主要品種的分子身份證，各品種均擁有獨立代碼，能夠對參試品種進行合理區分。

③對6個莖瘤芥品種的SSR標記差異分析結果表明，在分子水平上浙江本地品種間差異最大，平均差異位點5.3個；浙渝兩地品種差異次之，平均差異位點4.0個；重慶本地品種間差異最小，平均差異位點1.3個；6個莖瘤芥品種間平均差異位點3.7個。研究結果為莖瘤芥品種資源的鑒定、親緣關系分析、遺傳基礎研究等工作提供了依據。

3.2 討論

①SSR引物在不同作物、不同種屬間有一定的通用性[7，8]，并且隨著不同作物全基因組測序工作的廣泛開展，各大主要及非主要農作物SSR引物信息的公共數據庫相繼建成和不斷更新，在很大程度上克服了SSR引物開發困難、成本高的限制。但是SSR分子標記應用于種質鑒定過程中，多方面配套技術仍需進一步改進，以提高種質鑒定效率及可靠度[9]。

②本研究使用的引物根據蕓薹作物（http://www.brassica.info）公布的十字花科共同引物中篩選獲得，在后面的研究中應充分利用基因組學和生物信息學篩選或設計新的特異性SSR引物，克服莖瘤芥特異性的引物缺乏難題，加快探明莖瘤芥的遺傳進化背景，挖掘與定位莖瘤芥膨大、抽薹、抗病等重要功能基因，建立及完善莖瘤芥分子輔助育種技術等研究工作進程。

③通過SSR分子標記輔助育種，可以鑒定與了解莖瘤芥種質資源的遺傳基礎及親緣關系，能夠為莖瘤芥雜交組合配制的優化提供科學可靠的理論支撐。通過構建6個莖瘤芥主要品種的分子身份證，一定程度上顯示出莖瘤芥品種豐富的遺傳多樣性。同時本研究結果能夠為莖瘤芥登記品種分子數據庫的構建、莖瘤芥品種真實性與純度的鑒定提供科學依據，保證莖瘤芥種子生產、經營的有序健康發展。

④本研究篩選的引物與樣品量較少，試驗結果局限于7對SSR引物對6個莖瘤芥主要品種的差異性研究，今后應繼續深入研究更多莖瘤芥品種及種質資源的遺傳多樣性，以期為整個榨菜產業體系的持續健康發展提供強有力的科學理論支撐。

4 致謝

特此感謝重慶市渝東南農業科學院冷容、楊仕偉、李娟、冉廣葵、曾勝、張星星等科技人員在項目實施前期參與了SSR引物標記的篩選工作，為本試驗的開展提供了研究基礎。