底錦熙，陳振賀，李曉東，李 潔，鐘定榮*，曹 磊

（1.中日友好醫(yī)院 病理科，北京 100029；2.島津企業(yè)管理中國有限公司 中國創(chuàng)新中心，北京 100020）

隨著超聲檢測技術(shù)的普及，甲狀腺結(jié)節(jié)檢出率越來越高。為明確結(jié)節(jié)的良惡性，行進一步甲狀腺細(xì)針穿刺檢查的病例中，惡性腫瘤的診斷率約4%～8%，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）為主要類型[3]，約占所有甲狀腺惡性腫瘤的80%[1，2]。傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)診斷方法為金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時耗力。2020年西湖大學(xué)的研究人員基于蛋白質(zhì)組學(xué)和人工智能技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了甲狀腺癌的分子標(biāo)記物，可用于甲狀腺結(jié)節(jié)組織樣本的快速診斷，臨床應(yīng)用準(zhǔn)確率達到了90%以上[4]。PTC 組織存在很多特異性的代謝物[5，6]。課題組提出了采用探針電噴霧離子化質(zhì)譜測量特征代謝物的離子強度，基于人工智能技術(shù)快速診斷PTC的技術(shù)方案。該方案尚未見任何文獻報道。

本研究以細(xì)胞病理診斷過程中產(chǎn)生的廢液作為樣本，該廢液包含一定濃度的特征代謝物，經(jīng)簡單的處理后，應(yīng)用探針電噴霧離子化質(zhì)譜進行分析，獲得特征代謝物的離子強度。基于細(xì)胞病理診斷結(jié)果，采用支持向量機建立分類器，然后用于未知樣本的良惡性的判定。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

探針電噴霧離子化質(zhì)譜儀（DPiMS-8060，島津，日本）。BD保存液（畢迪醫(yī)療器械上海有限公司，批號491336）；甲酸（Dikma，批號5885877），乙醇（Fisher，色譜級，批號183349），超純水（Milli-Q，18.2MΩ.cm）。

1.2 臨床樣本來源

收集2020年7月～12月期間在中日友好醫(yī)院行甲狀腺細(xì)針穿刺術(shù)的樣本292 例。據(jù)甲狀腺細(xì)胞學(xué)Bethesda診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，由經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)生對樣本進行診斷。PTC 鏡下形態(tài)：（1）濾泡細(xì)胞呈乳頭狀和（或）成團片狀，單層細(xì)胞排列，漩渦狀細(xì)胞排列；（2）濾泡細(xì)胞的核特征：核增大；核呈卵圓形或不規(guī)則，有時出現(xiàn)核擁擠和重疊；縱行核溝；核內(nèi)假包涵體；染色質(zhì)粉塵狀，核淡染蒼白；可出現(xiàn)單個或多個小核仁，位于細(xì)胞核周邊[3]。良性病變鏡下形態(tài)：（1）含少量或中等數(shù)量的濾泡上皮細(xì)胞。（2）膠質(zhì)豐富，稀薄的水樣膠質(zhì)常呈“薄膜樣或玻璃紙樣”外觀，或出現(xiàn)較多皺褶，產(chǎn)生“碎石小徑樣”、“雞籠鐵絲網(wǎng)樣”或“馬賽克樣”的外觀；或是稠厚膠質(zhì)的質(zhì)地透明，且常有裂隙。（3）濾泡上皮細(xì)胞主要排列成單層片狀，并在其中均勻分布（呈“蜂窩狀”結(jié)構(gòu)）[3]。剔除可疑及診斷不一致的病例，最終納入289例樣本。

PTC 和良性病例樣本各109 例用于建立分類模型。單盲測試樣本71 例用于評價分類模型，PTC 39例、良性病例32例。其中同時行BRAF 基因突變檢測70 例，基因突變34 例、非突變36 例。有超聲診斷71例，高危38例、低危33例。

1.3 樣本的前處理

采集甲狀腺細(xì)針穿刺樣本制片過程產(chǎn)生的廢液（離心后分離的上清液）0.4ml，加入1ml 含0.35% 甲酸的乙醇水溶液。吸取10μl 放入DPiMS-8060專用液體樣品盤，啟動分析。

1.4 質(zhì)譜方法

采用探針電噴霧質(zhì)譜儀（DPiMS-8060）對樣本進行分析，DPiMS-8060由島津三重四級桿質(zhì)譜LCMS-8060 和探針電噴霧離子源（PESI）組成。PESI 和三重四級桿質(zhì)譜參數(shù)如下：離子源采用PESI，脫溶劑線溫度250℃，掃描模式Q3，加熱塊溫度30℃。掃描時間：正負(fù)模式各0.1min；掃描范圍：50～2000道爾頓。

PESI 取樣時間50ms。探針電壓：正模式2.3kV、負(fù)模式-3.0kV。取樣位置46.0mm，探針清洗時間：正負(fù)模式各0.05min，離子化200ms，探針采樣頻率2.78Hz。

1.5 建模方法

采集細(xì)胞學(xué)診斷為PTC和良性病變的樣本各109 例混合，建立數(shù)據(jù)庫。將細(xì)胞學(xué)診斷分組的上清液樣本進行質(zhì)譜分析，獲得特征代謝的離子強度。基于病理學(xué)診斷結(jié)果對用于模型學(xué)習(xí)的樣品進行分組后，導(dǎo)入eMSTAT 軟件（島津，日本），采用偏最小二乘回歸分析法（PLS-DA），歸一化方法為TIC，質(zhì)譜強度閾值1%，m/z識別范圍：0.2Da；數(shù)值處理方法：Log10。采用支撐向量機（support vector machine，SVM）方法，邊界約束（box constraint）和核函數(shù)范圍（kernel scale）均設(shè)為自動，交叉驗證類型：re-substitution。

1.6 評估指標(biāo)

比較模型預(yù)測結(jié)果與細(xì)胞病理診斷、BRAF基因突變檢測和超聲檢測的結(jié)果。用靈敏性、特異性和準(zhǔn)確率來評價模型。

2 結(jié)果

2.1 模型建立

eMSTAT 軟件提供2 種分組方法：PCA 和PLS-DA。圖1和圖2（見封底）分別為探針電噴霧離子源在PLS-DA 正模式和PCA 負(fù)模式下的分組結(jié)果。可見，正模式下PTC 組和良性組的樣本都能更好地聚集，而負(fù)模式下PTC 組和良性組的樣本相對分散。PCA負(fù)模式不能有效區(qū)分PTC組和良性結(jié)節(jié)，因此，最終采用正模式數(shù)據(jù)進行樣品分析。

圖1 PTC（藍色點）和良性（紅色點）樣本的分組結(jié)果（質(zhì)譜正模式）。

圖2 PTC（藍色點）和良性（紅色點）樣本的分組結(jié)果（質(zhì)譜負(fù)模式）

2.2 單盲驗證結(jié)果

以細(xì)胞病理診斷結(jié)果為參照，正模式質(zhì)譜條件下的特異性、靈敏度和準(zhǔn)確率為68.8%、53.8%和60.6%；負(fù)模式質(zhì)譜條件下的特異性、靈敏度和準(zhǔn)確率為62.5%、48.7%和54.9%。正模式質(zhì)譜條件下，以BRAF 基因診斷、超聲診斷作為參照，機器分類結(jié)果的準(zhǔn)確率分別為60.0%和56.9%。

3 討論

超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺結(jié)合細(xì)胞病理學(xué)診斷是甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性鑒別最常采用的方法[7，8]。在常規(guī)的診斷流程中，對懷疑甲狀腺癌的患者行穿刺術(shù)，或者穿刺液直接涂片，進行鏡下觀察；或是經(jīng)過處理后顯微鏡下觀察，處理過程通常先將穿刺液保存在合適的液基細(xì)胞保存液中，然后通過固定、離心、去上清、清洗及再離心等步驟得到干擾成分少的甲狀腺細(xì)胞液基涂片，再進行鏡下觀察。如果仍不能確診，還需要做分子病理檢查是否存在基因突變。臨床醫(yī)生綜合所有診斷結(jié)果做出最終診斷。人工智能閱片技術(shù)可以減少病理醫(yī)生的重復(fù)勞動。有文獻回顧了基于深度學(xué)習(xí)算法分析超聲圖像區(qū)分甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的方法[9]，還有文獻系統(tǒng)綜述了機器學(xué)習(xí)在甲狀腺腫瘤超聲診斷、細(xì)胞學(xué)診斷中的應(yīng)用[10，11]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與人工智能技術(shù)結(jié)合也被用于甲狀腺結(jié)節(jié)的快速診斷。

PTC 表現(xiàn)為細(xì)胞遺傳信息、蛋白質(zhì)表達、基礎(chǔ)代謝等發(fā)生改變[12～14]。基于BRAF 基因檢測的PTC 診斷方法已經(jīng)在包括中日友好醫(yī)院等眾多醫(yī)院得到廣泛應(yīng)用[4]。基于蛋白質(zhì)表達的變化和機器學(xué)習(xí)技術(shù)進行疾病診斷的方法也有報道[5]。然而，基于基礎(chǔ)代謝變化和機器學(xué)習(xí)進行疾病診斷的研究卻鮮未見報道。因此，我們設(shè)計了一種快速有效的PTC 診斷新方法：采用探針電噴霧離子化質(zhì)譜儀（DPIMS）進行樣品分析，快速獲得樣品中化合物的質(zhì)核比（m/z）和離子強度。通過機器學(xué)習(xí)進行多變量分析（如PCA 和PLS-DA 等方法），獲得在PTC 和其它疾病中種類和/或離子強度不同的化合物，并采用這些化合物去訓(xùn)練分類器，從而預(yù)測未知樣本的良惡性。細(xì)針穿刺診斷過程中產(chǎn)生的廢液（甲狀腺穿刺細(xì)胞保存液離心后的上清液）中含有少量的代謝物為癌細(xì)胞的特征代謝物。為驗證上述方案的可行性，采集了這些上清液作為實驗樣品。但是樣本中的代謝物濃度非常低，影響了質(zhì)譜檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，最終導(dǎo)致模型預(yù)測的準(zhǔn)確率低，不能應(yīng)用于臨床。從方法驗證的角度，準(zhǔn)確率為60.6%，對后續(xù)研究具有顯著的指導(dǎo)意義。

基于特征代謝物在質(zhì)譜上的離子強度和機器學(xué)習(xí)構(gòu)建的分類器，能夠?qū)TC 和良性樣本進行區(qū)分，但是準(zhǔn)確率較低，可能存在以下原因：（1）入組樣本的精細(xì)化區(qū)分。細(xì)胞病理學(xué)醫(yī)生診斷為良性病變的病例，是一組病變的總稱，又分為良性濾泡性結(jié)節(jié)、甲狀腺炎或其他少見病變。良性濾泡性結(jié)節(jié)是甲狀腺細(xì)胞學(xué)檢查中最常見的類型，包括一組具有相似細(xì)胞學(xué)特征的良性病變，相應(yīng)組織學(xué)診斷包括結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、腺瘤性結(jié)節(jié)、膠質(zhì)結(jié)節(jié)和彌漫性甲狀腺腫（Graves’病）的結(jié)節(jié)，以及一些濾泡性腺瘤亞型（大濾泡型）。甲狀腺炎癥性病變又包括淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎、亞急性甲狀腺炎和急性甲狀腺炎等。入組病例雖然均診斷為良性病變，但病變實質(zhì)存在差異，對應(yīng)樣本的代謝產(chǎn)物及化合物也有所差異，強行統(tǒng)一進入單一組別，將影響診斷的準(zhǔn)確性[3]。（2）入組和單盲測試樣本的有效性。分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)前采用的樣本的代謝物濃度不高。穿刺液樣本首先制備涂片樣本，殘留在穿刺針上樣本在18～20ml的細(xì)胞保存液種進行清洗和保存，然后離心并用高純水清洗后的樣本，再次制備液基細(xì)胞學(xué)涂片。我們采用的上清液樣本中，雖然含有少量的特征代謝產(chǎn)物，但是濃度比較低。在掃描離子模式下，平均離子強度在103～104數(shù)量級，略高于噪聲水平，在測定過程中受到的干擾比較大。（3）入組樣本均一性。甲狀腺細(xì)針穿刺過程中，由于結(jié)節(jié)大小、穿刺醫(yī)生技術(shù)能力、患者配合度等多環(huán)節(jié)問題，造成最終惡性腫瘤細(xì)胞在樣本中的含量有一定差異。

本次實驗沒有對上述參數(shù)進行有效控制和篩選，可能造成建模樣本有效物質(zhì)含量較低。以后可嘗試用穿刺原液和術(shù)中冰鮮組織樣本建庫，提高樣本質(zhì)譜信號強度，來提高診斷準(zhǔn)確性。