紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物的抗炎活性

張馨方，楊亞蘭，張 慧，羅非君，任佳麗

（中南林業科技大學食品科學與工程學院，林產可食資源安全與加工利用湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410004）

萜類化合物是分子式為異戊二烯單位倍數的烴類及其衍生物，廣泛分布在植物、動物和大型真菌中，結構多樣。目前已報道的萜類化合物的結構大約有50 000種，其中絕大多數萜類物質具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抑菌、抗人類免疫缺陷-1病毒、降血糖、降血脂等活性。食用菌中的萜類多為倍半萜、二萜和三萜。紅汁乳菇（）是一種美味的食藥用真菌，具有獨特的風味和豐富的營養物質，廣泛分布在我國的湖南、安徽、福建、四川、湖北和廣西等地。目前對紅汁乳菇中萜類物質的研究僅停留在初步的分離純化及結構解析上，對其生物活性尤其是抗炎活性的研究較少。因此，紅汁乳菇中的萜類化合物具有巨大的研究價值和開發潛力。

炎癥是機體的自我防御反應，主要的表現有局部紅腫、發熱、疼痛和功能性障礙，伴隨著白細胞數量增多和單核巨噬細胞增生等全身反應，長時間的炎癥會使機體產生一系列的異常應激反應，對機體自身造成不同程度的傷害，如引起動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、糖尿病等多種疾病，嚴重時甚至會導致癌癥。大量研究表明多種食用菌具有抗炎的作用，主要是通過減少炎癥介質的產生來達到抗炎的效果。

巨噬細胞在免疫系統中起到關鍵作用，致炎因子會誘導巨噬細胞分泌大量的炎癥因子，從而誘導炎癥反應發生。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導巨噬細胞模型常用于體外炎癥反應模擬，主要是通過檢測炎癥因子基因和蛋白相對表達水平的變化來評價活性物質的抗炎效果。當LPS作用巨噬細胞后，炎癥細胞因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin，IL）-1β、IL-6等表達量會顯著增加，并進一步促進其他炎癥介質的產生，從而引發炎癥。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是介導細胞反應的一種重要激酶，其信號傳導主要是三級激酶的傳遞模式，通過細胞外信號調節激酶1/2（extracellular regulated kinase 1/2，ERK1/2）、c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38 MAPK（以下簡稱p38蛋白）等蛋白質的磷酸化來調節多種細胞生理過程。因此，本研究以LPS誘導RAW264.7巨噬細胞為炎癥模型來評估紅汁乳菇愈創木烷型倍半萜化合物的抗炎活性，并初步探究紅汁乳菇愈創木烷型倍半萜化合物對MAPK通路的影響，旨在為紅汁乳菇的精深加工提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紅汁乳菇 長沙市馬王堆市場；甲醇（分析純）、氯仿（分析純）、乙酸乙酯（分析純）、丙酮（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；石油醚天津恒興化學品有限公司；柱色譜硅膠200～300 目青島海洋化工有限公司；1640培養基、胎牛血清、雙抗（青霉素、鏈霉素）、0.25%胰蛋白酶 美國Gibco公司；細胞增殖檢測（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2-tetrazolium，MTS）試劑盒、反轉錄試劑盒 美國Promega公司；TransZol、Green qPCR SuperMix UDG試劑盒 北京全式金生物技術有限公司；RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF） 北京索萊寶科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；-actin抗體、環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、IL-6、TNF-α、IL-1β一抗、磷酸化-MAPK（phospho-MAPK，P-MAPK）/MAPK抗體試劑盒、二抗抗兔免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、抗小鼠IgG1-辣根過氧化物酶顯色液試劑盒 美國CST公司。

1.2 儀器與設備

LABORATA 4001旋轉蒸發儀 德國海道爾夫集團；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；Bruker-100核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 德國布魯克公司；DNM-9602酶標儀 北京普朗新技術有限公司；XDS-10倒置生物顯微鏡 上海團結儀器制造有限公司；JY-SPCT水平電泳槽、JY300C電泳儀 北京君意東方電泳設備儀器公司；721-BR10883凝膠成像儀、CFX96 Touch實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物的提取與結構分析

愈創木烷型倍半萜化合物的提取：將新鮮的紅汁乳菇子實體用組織破碎機攪碎，室溫下靜置3 h后按照料液比1∶3（/）加入丙酮，室溫下靜置24 h進行浸提，過濾收集濾液，按照此操作浸提3 次，合并3 次的提取液。然后按照料液比1∶3（/）在濾渣中加入甲醇-氯仿混合溶液（體積比1∶1），室溫靜置浸提24 h，過濾收集濾液，按照此操作浸提2 次。合并收集的濾液，35 ℃旋轉蒸發除去溶劑，得到黑色浸膏。將上述全部黑色浸膏溶于150 mL乙酸乙酯，然后加入等體積水，收集乙酸乙酯相（上層）后于35 ℃真空蒸發除去溶劑，得到浸膏。柱層析：稱取一定質量（約為樣品質量30～70 倍）的200～300 目硅膠，將浸膏用純石油醚進行洗脫，收集藍色組分，35 ℃旋轉蒸發除去溶劑后將樣品凍干，得到愈創木烷型倍半萜化合物備用。

紫外-可見波段圖譜掃描：將0.1 mg愈創木烷型倍半萜化合物樣品溶于10 mL無水乙醇中，以無水乙醇為參比溶液進行全波長（200～800 nm）掃描，確定紅汁乳菇愈創木烷型倍半萜化合物的最大吸收波長。

高效液相色譜分析：稱取0.1 mg愈創木烷型倍半萜化合物，加入10 mL無水甲醇（色譜級）溶解，然后用無水甲醇稀釋10 倍，經0.22 μm濾膜過濾后備用。LC-20A高效液相色譜儀配備ODS C色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相純甲醇（色譜級），流速1 mL/min，檢測波長289 nm。

質譜條件：取液相色譜分析中制備的樣品進行質譜分析，質譜離子源為正離子ESI掃描，電離電壓3.5 kV，分辨率70 000，質量范圍100～1 500/。

NMR分析：稱取愈創木烷型倍半萜化合物10 mg，溶于0.5 mL氘代二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），進行氫譜、碳譜檢測，共振頻率400 MHz。

1.3.2 巨噬細胞RAW264.7細胞培養與細胞活性的測定

將RAW264.7細胞在含10%（體積分數）胎牛血清和1%（體積分數）雙抗（青霉素和鏈霉素）的1640細胞培養基（即完全培養基）中培養，并置于37 ℃、5% CO培養箱中，每2 d進行換液、傳代。取對數生長期的RAW246.7細胞，經0.25%（質量分數）胰蛋白酶消化后吹打均勻，用1640培養基稀釋至細胞密度為6×10個/mL，以每孔100 μL接種于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO培養箱中培養。待細胞貼壁后吸棄培養基，每孔加入含紅汁乳菇愈創木烷型倍半萜化合物（終質量濃度為0、25、50、100 μg/mL）的1640培養基，每組設置5個平行，重復3 次，輕輕振蕩，放入培養箱培養20 h后，每孔加入20 μL MTS溶液（5 mg/mL）。再次培養4 h后，采用酶標儀測定每個孔490 nm波長處的吸光度，以表征細胞活性；同時采用顯微鏡觀察細胞形態變化和生長情況（放大倍數為400×）。

1.3.3 LPS誘導巨噬細胞RAW264.7炎癥模型實驗分組

實驗分為5 組：空白對照組、LPS模型組、不同質量濃度（25、50、100 μg/mL）紅汁乳菇愈創木烷型倍半萜化合物組。參照1.3.2節方法將處于對數生長期的RAW246.7細胞經胰蛋白酶消化后，以10個/mL接種于6 孔板中，每孔1 mL，待細胞貼壁完全后吸棄培養液，然后按照分組加入不同培養基。紅汁乳菇愈創木烷型倍半萜化合物組：分別加入1 mL含不同質量濃度（25、50、100 μg/mL）紅汁乳菇愈創木烷型倍半萜化合物的完全培養基后在培養箱中孵育3 h，加入LPS使其終質量濃度為1 μg/mL；LPS模型組：加入1 mL含LPS（終質量濃度為1 μg/mL）的完全培養基；空白對照組：加入1 mL完全培養基。細胞培養24 h后，收集細胞做進一步分析。

1.3.4 熒光定量PCR檢測相關炎癥因子的mRNA相對表達水平

取1.3.3節收集的細胞，用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.2～7.4，下同）清洗2 次，用1 mL TransZol提取細胞總RNA，0.8%（質量分數）瓊脂糖膠電泳分析RNA的完整性和濃度，用反轉錄試劑盒合成cDNA后進行PCR。引物序列如表1所示，PCR反應條件：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s，60 ℃，40 s，72℃，1 min，40個循環。采用2法計算相關炎癥因子的mRNA相對表達水平。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR

1.3.5 Western blot法檢測蛋白相對表達水平

取1.3.3節各組的細胞，用磷酸緩沖液清洗2 次，加入0.3 mL含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液裂解細胞，然后4 ℃、13 000 r/min離心20 min，取上清液，BCA法測蛋白濃度，取20 μg的蛋白質樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，再將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上，并用5%牛血清白蛋白封閉液在室溫下封閉 1 h，然后與一抗在4 ℃下孵育12 h，TBST清洗3 次，膜與二抗在室溫下孵育 1 h 后，再用TBST清洗3 次，最后用曝光儀曝光拍照，并采用Image J軟件進行定量分析。

1.4 數據統計與分析

所有實驗均重復3 次，結果用平均值±標準差表示，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，采用檢驗進行顯著性分析，＜0.05為差異顯著，＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物的結構解析

對分離純化所得的化合物進行結構分析，圖1為紫外-可見波段掃描圖譜，在244、289、376 nm有3個吸收峰，最大吸收波長在289 nm處，根據Woodward-Fieser經驗規則，推測所得的化合物可能存在4個共軛雙鍵。由圖2可知，在6.5 min處有一高強度峰，根據面積歸一法初步推導其純度為96.7%。由圖3可知，在正離子模式下，所得的化合物的分子離子峰為/197.172 8。H NMR（圖4）和C NMR（圖5）的解析結果為，H NMR（DMSO-d6，400 MHz）：8.36（1H，d，＝2.0 Hz，H-8），7.69（1H，dd，＝10.9 Hz，2.0 Hz，H-6），7.64（1H，d，＝3.8 Hz，H-2），7.30（1H，d，＝3.8 Hz，H-3），7.07（1H，d，＝10.9 Hz，H-5），5.37（1H，brs，H-13a），5.20（1H，brs，H-13b），2.79（3H，s，H-14），2.62（3H，s，H-15），2.26（3H，brs，H-12）；C NMR（DMSO-d6，100 MHz）：146.4（s，C-4），145.1（s，C-11），136.9（s，C-7），136.5（d，C-8），135.0（s，C-10），134.0（d，C-6），132.8（s，C-9），131.7（d，C-5），127.1（s，C-1），124.5（d，C-2），114.4（t，C-13），113.8（d，C-3），23.5（q，C-14），22.9（q，C-12），12.8（q，C-15）。圖4和圖5結果與文獻[30]報道基本一致，故可以得出該化合物分子式為CH，結構式如圖6所示，為愈創木烷型倍半萜化合物。

圖1 紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物的紫外-可見波段掃描圖譜Fig. 1 UV-Vis spectrum of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake

圖2 紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物的高效液相色譜圖Fig. 2 High performance liquid chromatogram of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake

圖3 紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物的質譜圖Fig. 3 Mass spectrum of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake

圖4 紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物的1H NMR圖Fig. 4 1H NMR spectrum of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake

圖5 紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物的13C NMR圖Fig. 5 13C NMR spectrum of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake

圖6 紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物的結構式Fig. 6 Structural formula of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake

2.2 紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物對巨噬細胞形態和活性的影響

分別利用完全培養基（空白對照組）和含紅汁乳菇愈創木烷型倍半萜化合物（25、50、100 μg/mL愈創木烷型倍半萜化合物）的完全培養基培養巨噬細胞24 h后，觀察細胞形態變化和生長情況，如圖7所示，空白對照組和實驗組的巨噬細胞形態均完整無缺。MTS法檢測愈創木烷型倍半萜化合物對巨噬細胞活性的影響，如圖8所示，空白對照組和實驗組（25、50、100 μg/mL愈創木烷型倍半萜化合物）的吸光度分別為0.861±0.03、0.849±0.034、0.845±0.028、0.844±0.029，實驗結果表明，空白對照組和實驗組的吸光度沒有顯著差異（＞0.05），說明質量濃度為25、50、100 μg/mL的紅汁乳菇愈創木烷型倍半萜化合物不會影響巨噬細胞的活性，因此選擇這3個質量濃度進行后續實驗。

圖7 顯微鏡觀察紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物對巨噬細胞形態的影響（400×）Fig. 7 Effect of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake on morphology of macrophage RAW264.7 cells (400 ×)

圖8 紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物對巨噬細胞活性的影響Fig. 8 Effect of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake on the viability of RAW264.7 cells

2.3 紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物對LPS誘導巨噬細胞炎癥因子mRNA相對表達水平的影響

為了在基因水平上確定紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物的抗炎活性，采用PCR測定各組細胞中、、和mRNA的相對表達水平，結果如圖9所示。通過對比空白對照組、LPS模型組和實驗組（25、50、100 μg/mL愈創木烷型倍半萜化合物）細胞炎癥因子mRNA的相對表達水平可知：和空白對照相比，LPS模型組的、、和mRNA相對表達水平明顯升高，說明LPS成功誘導巨噬細胞產生炎癥反應，且這些細胞因子與LPS誘導的炎癥反應密切相關；和LPS模型組相比，實驗組中、、、mRNA表達水平均極顯著下降（＜0.01），且隨著愈創木烷型倍半萜化合物質量濃度不斷升高，表達量均不斷降低，呈現較好的濃度依賴性，說明該愈創木烷型倍半萜化合物能極顯著降低由LPS誘導的RAW264.7細胞中、、、mRNA相對表達水平（＜0.01）。

圖9 紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物對LPS誘導巨噬細胞炎癥因子mRNA相對表達水平的影響Fig. 9 Effect of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake on the relative mRNA expression level of inflammatory factors in LPS-induced RAW264.7 cells

2.4 紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物對LPS誘導巨噬細胞炎癥因子蛋白相對表達水平影響

為了在蛋白質水平上確定紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物的抗炎活性，采用Western blot法檢測相應炎癥因子蛋白質的表達，結果如圖10所示。和空白對照組相比，模型組的COX-2、IL-1β、iNOS、TNF-α、IL-6的相對表達水平均明顯升高，說明LPS成功誘導巨噬細胞產生炎癥反應。與已經誘導產生炎癥反應的模型組細胞相比，實驗組的COX-2、TNF-α、iNOS的蛋白相對表達水平均隨著該愈創木烷型倍半萜化合物質量濃度的升高而遞減，對于IL-1β和IL-6，僅有高質量濃度的愈創木烷型倍半萜化合物（100 μg/mL）能夠使其相對表達水平極顯著降低（＜0.01）。實驗結果說明一定質量濃度的紅汁乳菇愈創木烷型倍半萜化合物能降低LPS刺激的巨噬細胞中炎癥因子COX-2、IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-α的表達。

圖10 紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物對LPS誘導巨噬細胞炎癥因子蛋白相對表達水平的影響Fig. 10 Effect of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake on the relative protein expression levels of inflammatory factors in LPS-induced RAW264.7 cells

2.5 紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物對LPS誘導巨噬細胞中通路MAPK磷酸化的影響

為進一步研究紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物抵抗炎癥發生的機制，研究了其對MAPK信號通路變化的影響，結果如圖11所示。與空白對照組相比，LPS可以刺激巨噬細胞中磷酸化-JNK（phospho-JNK，p-JNK）、磷酸化-p38（phospho-p38，p-p38）、磷酸化-p44/42（phospho-p44/42，p-p44/42）蛋白相對表達水平明顯升高；與LPS模型組相比，不同質量濃度的紅汁乳菇愈創木烷型倍半萜化合物對p-p38蛋白表達的抑制效果較小且較為相近，當質量濃度達到100 μg/mL時，樣品會使p-JNK蛋白的表達明顯降低，而經梯度質量濃度的該愈創木烷型倍半萜化合物處理后，巨噬細胞中p-p44/42蛋白相對表達水平逐漸下降。結果表明一定劑量的紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物處理能極顯著降低p44/42、p38和JNK 3種蛋白激酶的磷酸化水平（＜0.01），從而抑制MAPK炎癥通路的活化。

圖11 紅汁乳菇中愈創木烷型倍半萜化合物對LPS誘導巨噬細胞MAPK通路中蛋白磷酸化水平的影響Fig. 11 Effect of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake on the phosphorylation of proteins involved in the MAPK signaling pathway in LPS-induced RAW264.7 cells

3 結 論

本研究從新鮮紅汁乳菇子實體中提取愈創木烷型倍半萜化合物，發現該化合物在0～100 μg/mL不會影響巨噬細胞的活性，采用LPS誘導RAW.264.7巨噬細胞模型，發現該化合物可以抑制炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS的分泌與表達；同時，可以降低p44/42、p38和JNK 3種蛋白激酶的磷酸化水平，通過抑制MAPK通路的活性，下調炎癥因子的表達，具有良好的抗炎活性。本研究對紅汁乳菇精深加工產品的開發具有一定的指導意義。