促成骨細胞增殖活性骨膠原蛋白肽的靶向篩選及活性分析

陳永凱，郭玉杰,2，張鴻儒，劉 泓，張春暉,*，姜 珊

（1.中國農業科學院農產品加工研究所，農業農村部農產品加工綜合性重點實驗室，北京 100193；2.新疆泰昆集團有限責任公司，新疆 昌吉 831100；3.內蒙古阿榮旗牧原康肽實業有限公司，內蒙古 呼倫貝爾 162750）

酶解法制備的骨膠原蛋白肽為混合肽，通常具有抗高血壓、抗骨質疏松、抗氧化和促進傷口愈合等多種潛在的生理功能。影響肽生物活性的主要因素包括一級結構（氨基酸的排列和組成）和肽鏈長度等，例如牦牛骨膠原蛋白肽GPAGPPGPIGPV（GP-12）能顯著促進成骨細胞增殖，而GPAGPAGPR（GP-9）和GEKGETGLR（GE-9）對成骨細胞增殖起抑制作用。在骨膠原蛋白分子的三股螺旋（2 條α肽、1 條α鏈）結構中，甘氨酸（Gly）是其特征氨基酸，與其他兩個氨基酸殘基（多為Pro和Hyp）共同構成（Gly-X-Y）的特征序列結構，可能是解析其生物活性的潛在“策略區”。因此，有必要進一步挖掘骨膠原蛋白肽的結構信息與促成骨細胞增殖活性之間的關系，為促成骨細胞增殖活性肽的定向制備提供參考。

活性肽構效關系的研究方法涉及體內實驗、體外實驗和虛擬篩選三大領域。體內實驗主要依靠建立動物模型，但成本高、周期長，常用作活性研究的最后一步。Yamada等前期研究發現牛乳酪蛋白肽MKP具有血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性，進一步通過建立自發性高血壓大鼠模型發現，三肽MKP能經小腸吸收進入血漿，顯著降低高血壓大鼠的收縮壓。體外實驗主要包括化學實驗、酶相關實驗和細胞培養實驗等，可直接驗證肽的生物活性，但不適合初期大規模篩選，多與其他分離純化技術聯用。顏阿娜等采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除實驗，結合高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法成功鑒定出了黑鯊魚皮抗氧化肽PGGTM。計算機輔助虛擬篩選技術可有效彌補體內實驗和體外實驗的不足，提高篩選效率，常見的虛擬篩選方法包括定量-構效關系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）建模、數據庫檢索和分子對接等。在篩選促成骨細胞增殖活性肽的相關研究中，可將肽與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）進行半柔性對接，以對接能（CDOCKER energy，CE）評價其潛在的促增殖活性，此法在促成骨細胞增殖牛骨膠原蛋白肽和乳鐵蛋白肽的篩選中均取得了良好的效果。

牦牛是我國珍貴的畜牧資源，牦牛屠宰產生的骨副產物質量約占胴體質量的20%～30%，但綜合利用卻嚴重不足，現已證實牦牛骨膠原蛋白肽具有良好的成骨活性，能顯著改善去卵巢骨質疏松大鼠模型癥狀。本研究采用酶法制備牦牛骨膠原蛋白肽，通過CDOCKER分子對接技術靶向篩選作用于EGFR的促成骨細胞增殖活性肽段，基于體外細胞增殖培養驗證其活性并闡釋與EGFR的結合機制，以期為促成骨細胞增殖活性肽的靶向篩選和工業化制備提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牦牛腿骨由西藏農牧學院提供；牦牛骨膠原蛋白肽由北京華大蛋白質研發中心有限公司合成，經鑒定純度均大于98%；小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

乙腈（質譜級） 美國Fisher Chemical公司；甲酸（質譜級）、三氟乙酸（色譜級） 美國Sigma-Aldrich公司；CCK-8溶液 北京索萊寶科技有限公司；復合蛋白酶 丹麥Novozymes公司。

1.2 儀器與設備

中試生產裝備（包括破骨機、工業純水機、蒸煮罐、靜置罐管式冷卻器、管式分離機、碟式分離機、脫色罐、單效蒸發器、噴霧干燥機） 上海本優機械有限公司；1260-II型HPLC儀 美國Agilent公司；Ultimate 3000型毛細管HPLC儀、電噴霧-組合型離子阱質譜儀、Multiskan FC型酶聯免疫檢測儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；Infinite M200型恒溫培養箱 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛骨膠原蛋白肽制備流程

牦牛骨破碎→沖洗血污→熱壓提取（135 ℃、3 h）→靜置分層（1.5 h）→酶解脫色（1.5 AU/g復合蛋白酶，56 ℃、4.5 h）→噴霧干燥（進風溫度190 ℃、出風溫度80 ℃）

1.3.2 牦牛骨膠原蛋白肽分子質量分布測定

參考Ye Mengliang等的方法并稍作修改，采用HPLC法測定牦牛骨混合肽分子質量分布，配制質量濃度為5.0 mg/mL的標準品甘氨酰肌氨酸（146 Da）、甘氨酰甘氨酰酪氨酰-精氨酸（451 Da）、桿菌肽（1 422 Da）、抑肽酶（6 511 Da）、細胞色素c（12 327 Da）以及牦牛骨混合肽溶液，經0.22 μm膜過濾，待用。色譜條件：TSK gel G2000 SWXL柱（7.8 mm×300 mm），柱溫30 ℃，進樣量10 μL，進樣3 次，流速1.0 mL/min，流動相為含45%（體積分數，下同）乙腈和0.1%三氟乙酸的超純水溶液，采用等梯度洗脫，洗脫時間為20 min，于214 nm波長處測吸光度，以標準品分子質量對數（lg）為縱坐標，保留時間（）為橫坐標建立標準曲線，采用手動積分的方式測定不同分子質量活性肽的占比。

1.3.3 牦牛骨膠原蛋白肽序列測定

采用納米液相色譜-串聯質譜（nano liquid chromatogram-tandem mass spectrometry，nano LC-MS/MS）測定牦牛骨膠原蛋白肽序列。

1.3.3.1 液相分離條件

預柱：Acclaim PepMap RPLC C柱（5 mm×300 μm，5 μm）；分析柱：Acclaim PepMap RPLC C柱（150 mm×150 μm，5 μm）；流動相A：0.1%甲酸+2%乙腈；流動相B：0.1%甲酸+80%乙腈；流速：600 nL/min；梯度洗脫條件：0～5 min，6%～9% B；5～20 min，9%～14% B；20～50 min，14%～30% B；50～58 min，30%～40% B；58～60 min，40%～95% B。

1.3.3.2 質譜分析條件

采用正離子掃描模式；設定毛細管溫度320 ℃、毛細管噴射電壓2 300 V。一級質譜參數：分辨率：70 000；AGCtarget：3×10；MaximumIT：40 ms；掃描范圍：350～1 800/。二級質譜參數：分辨率：75 000；AGCtarget：1×10；MaximumIT：60 ms；Top N：20；NCE/stepped NCE：27。

1.3.3.3 數據庫檢索

使用Maxquant 1.6.2.10平臺分別檢索目標多肽。

1.3.4 EGFR和多肽前處理

從Protein Data Bank（PDB）數據庫（http://www.rcsb.org/）下載EGFR-表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）（PDB編號：1IVO）復合物結構，采用Discovery Studio 2019軟件刪去原配體EGF和水分子，添加氫原子，補充非完整的氨基酸殘基并模擬缺失的loop區域；分別繪制牦牛骨肽的一級序列，添加CHARMm力場，采用Smart Minimizer算法對其進行能量最小化處理，最大步數設定為2 000 步，RMS梯度值設為0.01。

1.3.5 活性口袋確定

以EGF和EGFR的結合位點為對接位點，設定活性口袋半徑為22，將原配體結合區域完全包裹。

1.3.6 分子對接

定義經過前處理的多肽為配體，EGFR為受體，使用Discovery Studio 2019軟件的CDOCKER半柔性對接方式進行分子對接，僅保留一個CE最低的構象。以具有促成骨細胞增殖活性的牦牛骨膠原蛋白肽GDRGETGPAGPAGPIGPV（GD-18）和GPSGPAGKDGRIGQPG（GP-16）為陽性對照，選取CE較陽性肽CE差值大于20 kcal/mol的多肽用于后續研究。

1.3.7 多肽合成

參考Xu Zhe等的方法，采用固相合成技術合成牦牛骨膠原蛋白肽GP-18、TP-14、GP-17、GK-21和GK-22，HPLC-MS檢驗純度，均大于98%。

1.3.8 多肽促成骨細胞增殖活性驗證

參考 Zhu Lingyu等的方法并稍作修改，將小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1細胞以2×10個/mL、每孔100 μL接種于96 孔板中，恒溫培養24 h后移去原培養基，隨后配制系列質量濃度梯度的多肽溶液，以每孔200 μL加入96 孔板中，在溫度為37 ℃、CO體積分數為5%的恒溫培養箱中連續培養48 h，空白組加入等體積培養基，采用CCK-8法測定增殖率，每組實驗做4 次平行。按下式計算前成骨細胞的相對增殖率。

式中：為樣品溶液的吸光度；為空白組溶液的吸光度。

1.4 數據處理與分析

本實驗采用SPSS 22.0軟件進行Duncan方差分析，設定顯著性水平＜0.05或＜0.01，結果以平均值±標準差的形式表示；繪圖軟件為Origin 2016。

2 結果與分析

2.1 牦牛骨膠原蛋白肽分子質量分布

標準品分子質量的對數lg與保留時間呈現良好的線性關系（＝0.979 4），說明測定結果具有較高的可信性。根據GB 31645—2018《食品安全國家標準 膠原蛋白肽》的定義，膠原蛋白肽是指以富含膠原蛋白的新鮮動物組織（包括皮、骨、筋、腱、鱗等）為原料，經過提取、水解、精制生產的，分子質量低于10 000 Da（質量分數不低于90%）的產品。如圖1所示，分子質量小于3 000 Da的肽段占91.8%，其中小于1 000 Da的占69.2%，說明該批肽粉符合國家標準。

研究發現，低分子質量的牛骨膠原蛋白肽（＜3 000 Da）、牦牛骨膠原蛋白肽（＜3 000 Da）以及豬骨膠原蛋白肽（＜1 000 Da）均能顯著促進MC3T3-E1細胞增殖，發揮成骨活性。因此，本實驗制備的牦牛骨膠原蛋白肽可能具有開發成為抗骨質疏松功能食品的潛在價值，故進行后續實驗。

圖1 牦牛骨膠原蛋白肽分子質量分布Fig. 1 Molecular mass distribution of yak bone collagen peptides

2.2 牦牛骨膠原蛋白肽序列分析

膠原蛋白呈現典型的三股螺旋結構，具有良好的生物相容性且易于加工利用。自然界中共存在28種膠原蛋白，其中I型膠原蛋白含量最高，廣泛分布于動物的皮膚、骨骼和肌腱等部位。如表1所示，本實驗中從牦牛骨膠原蛋白肽中共鑒定得到78 條肽段，其中I型膠原蛋白肽占比為82.0%，來源于α鏈和α鏈的肽分別占I型膠原蛋白肽總量的45.3%和54.7%，并且其序列均與膠原蛋白的（Gly-X-Y）特征序列相吻合，表明鑒定結果具有較高的可靠性。

表1 牦牛骨膠原蛋白肽序列及分子對接結果Table 1 Yak bone peptide sequences and their -CDOCKER energy(-CE) values

續表1

值得注意的是，分子質量分布測定結果表明混合肽中有大約45.1%的肽分子質量小于500 Da，根據里賓斯基五規則，分子質量小于500 Da的化合物往往具有較高的生物利用度和較好的藥物代謝動力學性質，更易開發成為口服藥物，但本實驗鑒定的分子質量小于500 Da的肽只有一條——FSGL（422.224 Da）。導致質譜對小肽鑒定能力差的原因可能是太小的片段在分離中不容易獲取，或者組分間性質差異小，無法區分。

2.3 分子對接實驗結果

EGFR是受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）家族的成員，在無配體時，EGFR胞外域的第II亞結構域和第IV亞結構域會形成分子內“鉸鏈”，形成自抑制狀態；當配體與胞外域結合后，EGFR構象改變并發生二聚化，啟動下游信號通路，促進細胞增殖或分化。研究表明，以EGFR為受體，通過CDOCKER對接獲得的乳鐵蛋白肽ENLPEKADRDQYE、牛骨膠原蛋白肽HHGDQGAPGAVGPAGPRGPAGPSGPAGKDGR和GPAGANGDRGEAGPAGPAGPAGPR具有顯著的促成骨細胞增殖活性。在小分子配體與大分子受體對接研究中，可用-CE表示受體和配體親和力的大小，-CE越大，受體與配體結合越穩定。如表1所示，將鑒定的多肽與EGFR對接后，-CE的變化范圍從21.493 kcal/mol到170.507 kcal/mol，其中陽性肽GD-18和GP-16的-CE分別為134.759 kcal/mol和132.988 kcal/mol。-CE比陽性肽高20 kcal/mol以上的多肽共有5 條，分別為GP-18（162.390 kcal/mol）、TP-14（167.276 kcal/mol）、GK-21（170.507 kcal/mol）、GK-22（162.093 kcal/mol）和GP-17（156.133 kcal/mol），除TP-14來源于-乳球蛋白以外，其余均來自于I型膠原蛋白的α鏈。

2.4 促成骨細胞增殖活性分析

本實驗采用CCK-8法測定MC3T3-E1細胞相對增殖率，CCK-8法較其他常見的檢測方法具有結果穩定、靈敏度高、重復性好等優勢。如圖2所示，將細胞在多肽質量濃度分別為0.1、0.5、1.0 mg/L和3.0 mg/mL條件下分別培養48 h，發現當質量濃度不低于1.0 mg/mL時，所有多肽均無顯著的促MC3T3-E1細胞增殖活性，GP-17、GP-18和TP-14甚至能抑制細胞增殖；當質量濃度為3.0 mg/mL時，GK-22能顯著促進MC3T3-E1細胞的增殖（相對增殖率為106%），并且表現出劑量-效應關系，說明GK-22序列可能是促進MC3T3-E1細胞增殖的特征性序列，具有潛在的研究價值。值得注意的是，GK-21的序列僅與GK-22相差一個末端Gly殘基，卻無顯著的促增殖活性，因此末端Gly殘基對GK-22的促成骨細胞增殖具有重要意義。

圖2 MC3T3-E1細胞增殖率測定結果Fig. 2 Determination of MC3T3-E1 cell proliferation

2.5 不同多肽與EGFR的結合機制

配體與EGFR親和力的差異會導致EGFR產生不同的二聚化構象，繼而引發細胞增殖或分化。上皮調節蛋白（epiregulin，EREG）等弱親和力配體會誘導細胞分化而抑制增殖；EGF等強親和力配體作用效果相反，某些拮抗劑可以與EGFR胞外域結合，進而掩蓋配體的結合位點，致使EGFR內部酪氨酸激酶激活過程受阻，細胞增殖受到抑制。如圖3和表2所示，GK-22與EGFR的非鍵相互作用主要為氫鍵和疏水相互作用，可與EGFR的Lys13、Leu14和Thr15形成5個氫鍵（包括常規氫鍵和碳氫鍵，與Lys13和Thr15各形成2個氫鍵），與Leu17和His409分別形成烷基相互作用和π-烷基相互作用。同時，陽性肽GP-16也與EGFR的Lys13和Thr15形成氫鍵；GD-18與Thr15形成氫鍵，與Leu17和His409形成烷基相互作用，提示GK-22可能與兩者存在相似的促成骨細胞增殖機制。而分子對接結果表明GK-21與EGFR的親和力高于GK-22，并且可與Leu14、Thr15、Gln16、Leu17、Tyr45和Gln384形成氫鍵，與Leu17、Leu325、His346和His409形成疏水相互作用，除Lys13外，涵蓋了GK-22與EGFR的所有結合位點，卻未與GK-22一樣表現出促增殖活性，原因有待進一步研究。GP-17、GP-18和TP-14與EGFR的非鍵相互作用除氫鍵和疏水相互作用外，還包括靜電相互作用。GP-17與EGFR形成8個氫鍵、1個電荷相互作用、1個烷基相互作用；其中EGFR的Asp355殘基與之形成4個氫鍵（含2個碳氫鍵、1個常規氫鍵、1個鹽橋）、1個電荷相互作用，是兩者結合的關鍵氨基酸殘基。GP-18與EGFR形成9個氫鍵、1個π-烷基相互作用、1個電荷相互作用；TP-14與EGFR形成10個氫鍵，1個π-陽離子相互作用、1個烷基相互作用。因此，GK-22可能是EGFR的強親和力配體，而對MC3T3-E1細胞增殖發揮抑制作用的GP-17、GP-18和TP-14可能是EGFR的弱親和力配體，或者其作為EGFR的拮抗劑，使正常配體的結合過程受阻。綜上，不同多肽對MC3T3-E1細胞增殖產生不同效應的原因可能是與EGFR的結合機制存在差異。

圖3 不同多肽與EGFR的非鍵相互作用Fig. 3 Non-bond interactions between different polypeptides and EGFR

表2 多肽與EGFR的結合位點Table 2 Interaction sites between polypeptides and EGFR

續表2

3 結 論

骨膠原蛋白經復合酶酶解可獲得低分子質量（＜3 000 Da）的混合肽，但發揮促成骨細胞增殖活性的肽序列尚不明確。本研究采用nano LC-MS/MS技術測定混合肽序列，以牦牛骨膠原蛋白肽GD-18和GP-16為陽性對照，通過CDOCKER半柔性對接技術篩選獲得具有潛在促成骨細胞增殖活性的牦牛骨膠原蛋白肽GP-18、TP-14、GP-17、GK-21和GK-22，體外細胞增殖培養實驗進一步表明，GK-22可通過與EGFR結合，發揮促成骨細胞增殖活性。綜上，基于以EGFR為受體的CDOCKER半柔性對接技術，可實現促成骨細胞增殖活性骨膠原蛋白肽的靶向篩選。