血清miRNA-19b在早期非小細胞肺癌輔助診斷中的臨床價值

王達 馬異峰 馬尚 白萬秋 居文福 時廣利

肺癌是我國大中城市高發的癌癥之一，在各種惡性腫瘤中，肺癌的死亡率排在第一位，NSCLC大約占肺癌中85%[1-2]。大約75%的NSCLC患者確診時已經是晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)，其5年生存率不到20%。而早期NSCLC患者(I期或Ⅱ期)，尤其是Ⅰ期患者，其5年生存率可達到80%[3]。因此，目前降低NSCLC患者死亡率的關鍵是早診斷、早治療。微小RNA(miRNA)屬于非編碼RNA，調節著人類約三分之一基因的表達[4]。miRNA與癌癥的發生、發展相關聯，并且能夠非常穩定地存在于人的血清中[5]。本課題組在前期的研究中發現血清miRNA-19b在NSCLC患者中異常表達。因此，本課題應用qRT-PCR法測定miRNA-19b在早期NSCLC患者血清中的表達水平，并與目前臨床常用的腫瘤標志物癌胚抗原(CEA)和細胞角蛋白(Cyfra21-1)比較，探討其在早期NSCLC輔助診斷中的臨床應用價值。

資料與方法

一、對象

病例組為2019年10月至2020年6月首都醫科大學附屬北京胸科醫院胸外科經病理組織學確診的初治早期NSCLC(I期和Ⅱ期)患者100例，其中男性和女性患者各50例，男性患者年齡35～72歲(平均58.2歲)、女性患者年齡35～67歲(平均51.1歲)；其中腺癌患者82例、鱗癌患者18例、I期患者83例、Ⅱ期患者17例。根據國際癌癥聯合協會(UICC)制定的標準進行NSCLC分期。健康人對照組為首都醫科大學附屬北京胸科醫院體檢健康職工50名，其中男性和女性各25名，男性年齡45～60歲(平均55.6歲)、女性年齡46～60歲(平均51.5歲)。所有研究對象無急性感染，無心臟病史，無高血糖、高血壓等疾病，所有NSCLC患者既往未經過放療或化療。

二、標本采集和處理

抽取100例早期NSCLC患者和50名健康人空腹外靜脈血3mL(非抗凝)，室溫靜置30min，離心20分鐘(3000轉/分)。然后提取血清1.5mL, -80℃超低溫冰箱凍存。本研究經北京市結核病胸部腫瘤研究所倫理委員會審核通過(倫理號：科研2020-20)。

三、研究方法

1.血清樣本miRNA的提取：使用RNA提取試劑盒(北京天根公司，型號：DP430)提取血清中的總miRNA，并用紫外分光光度計檢測miRNA純度，具體操作方法參照試劑盒說明書。

2.逆轉錄：使用miRNA第一鏈cDNA反轉錄試劑盒(北京天根公司，型號：KR118-02)進行提取后的miRNA逆轉錄，反應體系為20ul，具體操作方法參照試劑盒說明書。

3.qRT-PCR：采用SYBR Green熒光法，使用北京天根生化公司生產的qRT-PCR試劑盒(型號：FP205-02)。應用ABI7500PCR擴增儀進行qRT-PCR，反應體系為20ul，以U6作為內參照。PCR反應擴增條件：94℃預變性2分鐘，然后94℃20秒、60℃34秒、共進行45個循環，miRNA-19b的相對表達量以2-ΔCt表示，反應體系(見表1)。

表1 qRT-PCR反應體系

4.血清CEA和Cyfra21-1的檢測：釆用流式熒光免疫法，應用血清CEA、Cyfra21-1測定試劑盒和流式點陣儀完成(上海透景公司，型號：TESMI)，具體操作方法參照試劑盒和儀器說明書。

四、統計學分析

實驗數據以中位數(M)和四分位數間距(IQR)表示，采用SPSS17.0軟件進行統計學分析。組間數據比較采用秩和檢驗，應用受ROC判斷miRNA-19b在早期NSCLC中的臨床應用價值，組間率的比較采用χ2檢驗，P<0.05時差異具有統計學意義。

結 果

一、血清miRNA-19b、CEA、Cyfra21-1在早期NSCLC中的相對表達量

如表2～4所示，血清miRNA-19b在早期NSCLC患者中的表達水平顯著高于健康人對照組，差異有顯著統計學意義(Z=9.532,P<0.001)；血清miRNA-19b在肺腺癌中的表達水平與肺鱗癌比較，差異無統計學意義(Z=1.920,P>0.05)；血清miRNA-19b在I期NSCLC中的表達水平高于Ⅱ期，差異有統計學意義(Z=2.418,P<0.05)。血清CEA在早期NSCLC患者中的表達水平與健康人對照組比較，差異無統計學意義(Z=0.490,P>0.05)；血清CEA在肺腺癌中的表達水平高于肺鱗癌，差異有統計學意義(Z=2.221,P<0.05)；血清CEA在I期NSCLC中的表達水平與Ⅱ期比較，差異無統計學意義(Z=1.326,P>0.05)。血清Cyfra21-1在早期NSCLC患者中的表達水平與健康人對照組比較，差異無統計學意義(Z=0.157,P>0.05)；血清Cyfra21-1在肺鱗癌中的表達水平高于肺腺癌，差異有統計學意義(Z=3.158,P<0.01)；血清Cyfra21-1在Ⅱ期NSCLC中的表達水平高于I期，差異有統計學意義(Z=2.299,P<0.05)。

表2 血清miR-19b在早期NSCLC中的相對表達量M(IQR)

二、血清miRNA-19b、CEA和Cyfra21-1在早期NSCLC中的敏感性和特異性

表3 血清CEA在早期NSCLC中的相對表達量M(IQR)

表4 血清Cyfra21-1在早期NSCLC中的相對表達量M(IQR)

如表5所示，血清miRNA-19b在早期NSCLC中的敏感性(63.0%)顯著高于CEA和Cyfra21-1的敏感性(4.0%和9.0%)，差異均具有顯著統計學意義(P<0.001)，特異性無明顯差異。

表5 血清miRNA-19b、CEA和Cyfra21-1在早期NSCLC中的敏感性和特異性

三、血清miRNA-19b、CEA和Cyfra21-1在早期NSCLC中的診斷價值

如圖1～3所示，ROC曲線分析顯示，miRNA-19b在早期NSCLC中的診斷價值明顯好于CEA和Cyfra21-1。血清miRNA-19b的曲線下面積(AUC)為0.978,95%置信區間(CI)：0.95～1.000；CEA的AUC為0.525,95%CI：0.421～0.628；Cyfra21-1的AUC為0.492,95%CI：0.386～0.598。

圖1 血清miRNA-19b在早期NSCLC中的ROC曲線

討 論

目前, 肺部CT檢查大大提高了肺癌篩查的陽性率，但是螺旋CT在區分良性和惡性微結節方面準確率不高[6-7]。肺癌相關血液腫瘤標志物的檢測相比其它方法(肺部CT、支氣管鏡等)具有取材方便、創傷性小、成本低廉的優勢。我國制定的肺癌診療規范建議CEA、SCC、Cyfra21-1可用于NSCLC的診斷、療效監測和預后判斷[8]。但是，這些腫瘤標志物在早期NSCLC診斷中的敏感性比較低，只有10～20%[9]。因此，目前迫切需要尋找敏感性和特異性都比較好的肺癌腫瘤標志物來發現更多的早期NSCLC患者，從而降低肺癌的死亡率。

圖2 血清CEA在早期NSCLC中的ROC曲線

圖3 血清Cyfra21-1在早期NSCLC中的ROC曲線

miRNA屬于單鏈非編碼小RNA的一種，在腫瘤的發生、發展中有致癌和抑癌的不同作用，miRNA有可能成為新的與肺癌早期進程相關的腫瘤標志物[10-11]。關于血清中miRNA的來源，目前認為主要是由壞死或凋亡的細胞釋放入血，或者來自于腫瘤細胞釋放的內源性miRNA進入外周血[5]。有研究顯示，NSCLC患者血清miRNA-133b的相對表達量低于健康人對照組(P<0.05)，而血清miRNA-150的相對表達量高于對照組(P<0.05)，這2個指標聯合在肺癌檢測中的敏感性為76.6%、特異性為73.3%[12]。張幫林等[13]的研究結果也表明，NSCLC患者血清miRNA-145的相對表達量低于健康人對照組(P <0.01)，而血清miRNA-21和miRNA-197的相對表達量高于對照組(P<0.01)，聯合這3個指標在肺癌檢測中的敏感性為91.58%、特異性為79.86%。安志杰等[14]的研究結果顯示，miRNA-155和miRNA-625在NSCLC患者血漿中異常表達，其敏感性為75.51%和73.47%。目前的這些外周血miRNA與肺癌的相關研究提示，血清中miRNA的表達水平與肺癌的發生、發展密切相關，并且在肺癌的早期形成階段，miRNA有可能就參與其中，發揮著關鍵性的作用。但是目前這些研究的主要研究對象是晚期NSCLC(Ⅲ期和Ⅳ期)患者，而早期NSCLC(I期和Ⅱ期)患者較少，并且未發現有血清miRNA-19b與早期NSCLC相關研究的報道。

本研究的實驗結果顯示，血清CEA和Cyfra21-1在早期NSCLC患者中的表達水平與健康人對照組比較無顯著差異(P>0.05)，并且CEA和Cyfra21-1在早期NSCLC中的敏感性只有4.0%和9.0%，說明CEA和Cyfra21-1在早期NSCLC中的診斷價值不高。而血清miRNA-19b在早期NSCLC患者中的表達水平顯著高于健康人對照組(P<0.001)。血清miRNA-19b在早期NSCLC中的敏感性為63.0%、特異性為98%，顯著高于CEA和Cyfra21-1的敏感性(P<0.001)。ROC曲線分析顯示，血清miRNA-19b的AUC達到了0.978，明顯高于CEA(AUC：0.525)和Cyfra21-1(AUC：0.492)，說明血清miRNA-19b在早期NSCLC中的診斷價值明顯好于CEA和Cyfra21-1。以上研究結果表明，血清miRNA-19b在早期NSCLC輔助診斷中的價值顯著優于CEA和Cyfra21-1，有可能成為早期NSCLC篩查的參考指標，具有非常大的潛在臨床應用價值。