高效液相色譜法測定溫郁金藥材醋制前后5 種成分含量*

喬溪瑩，甕學智

（1.北京中醫藥大學附屬護國寺中醫醫院，北京 100035； 2.北京市豐臺區食品藥品安全監控中心，北京 100071）

溫郁金為姜科植物溫郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥塊根，具有活血止痛、行氣解郁功效，是中醫治療痛經、乳房脹痛、胸腹刺痛的常用藥物［1］。溫郁金藥材中含有莪術烯醇、莪術二酮、莪術醇、吉馬酮、β?欖香烯等活性成分，可通過醋制、酒制等加工提純方式制成多種成品［2］。醋制是常用的加工炮制方式，會影響中藥成分含量［3］。目前，針對溫郁金藥材醋制前后有效成分含量的變化仍有爭議。因此，本研究中探討了溫郁金藥材醋制前后莪術烯醇、莪術二酮、莪術醇、吉馬酮、β?欖香烯5 種有效成分含量的變化情況，旨在明確該炮制方式對溫郁金藥材有效活性成分的影響，為后續溫郁金藥材的加工炮制及臨床應用提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC ?20AT 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；CP225D型分析天平（德國Sartorius公司，精度為十萬分之一）；KQ ?250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW100型萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；Millipore超純水處理系統（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

莪術二酮對照品（批號為111800 ?201302，含量99.8%），莪術醇對照品（批號為100185 ?201908，含量99.9%），吉馬酮對照品（批號為111665 ?201906，含量99.8%），β?欖香烯對照品（批號為100268 ?201903，含量99.4%），均購自中國食品藥品檢定研究院；莪術烯醇對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號為R21M9F61833，含量≥98%）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。溫郁金藥材樣品，2020 年2 月采集于浙江省溫州市的溫郁金種植示范基地，由北京市藥品檢定研究院中藥飲片檢驗員杜小偉鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Sunfire ?C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）?0.5%冰醋酸水溶液（B），梯度 洗 脫（0～13 min 時42%A，13～20 min 時42%A→50%A，20～40 min 時50%A→80%A，40～42 min 時80%A→90%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：214 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取莪術烯醇、莪術二酮、莪術醇、吉馬酮、β?欖香烯對照品各10 mg，精密稱定，置5 mL棕色容量瓶中，加甲醇充分溶解并定容，得質量濃度分別為1.061，1.023，1.016，1.007，1.035 mg/mL 的單一對照品貯備液；分別吸取適量置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，按2 倍稀釋法稀釋，獲得對應的對照品溶液，加甲醇定容即得混合對照品溶液。取藥材樣品適量，制備溫郁金生片，以5∶1（m/V）比例混合溫郁金生片與米醋，密封2 h后蒸15 h，取出晾干并研磨成粉，取1 g（過40目篩），精密稱定，加入甲醇20 mL，密塞稱定質量，超聲（功率200 W，頻率50 kHz）處理40 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

1.莪術烯醇 2.莪術二酮 3.莪術醇 4.吉馬酮 5.β ?欖香烯A.混合對照品溶液 B.供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Curcumenol 2.Curdione 3.Curcumol 4.Germacrone 5.β ?elemeneA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

系統適用性試驗：精密吸取2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜相應位置有吸收峰，且分離度均大于1.5，基線分離良好；理論板數按莪術烯醇峰計應大于3 000。詳見圖1。

線性關系考察：取2.2 項下混合對照品溶液適量，加甲醇稀釋，得莪術烯醇質量濃度分別為31.830，15.915，7.957，3.979，1.989 μg/ mL，莪術二酮質量濃度分別為204.60，102.30，51.15，25.58，12.79 μg/mL，莪術醇質量濃度分別為30.480，15.240，7.620，3.810，1.905 μg/ mL，吉馬酮質量濃度分別為100.700，50.350，25.180，12.590，6.294 μg/mL，β?欖香烯質量濃度分別為103.500，51.750，25.880，12.940，6.469 μg/mL的系列混合對照品溶液。取適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程。結果見表1。

精密度試驗：取醋制后飲片樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，平行測定6次，記錄峰面積。結果見表1，表明方法精密度良好。

穩定性試驗：取2.2項下供試品溶液，室溫下放置0，2，4，8，16，24 h時，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果見表1，表明供試品溶液室溫放置24 h內穩定。

表1 線性關系考察及精密度、穩定性、重復性試驗結果Tab.1 Results of the linear relation，precision，stability and repeatability tests

重復性試驗：取醋制后飲片樣品，按2.2 項下方法平行制備6 份供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果見表1，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取醋制后飲片樣品共6 份，每份0.5 g，精密稱定，分別精密加入一定質量濃度的混合對照品溶液，再定容至20 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取醋制前后的樣品粉末各1 g，分別按2.2 項下方法平行制備3 份供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，結果見表3。可見，醋制后的飲片樣品中莪術烯醇、莪術二酮、莪術醇、吉馬酮、β?欖香烯的含量均較醋制前低。

表3 溫郁金藥材醋制前后的5種成分含量變化（±s，μg/g，n=3）Tab.3 Content changes of five components in Curcuma wenyujin before and after processing with vinegar（±s，μg/g，n=3）

表3 溫郁金藥材醋制前后的5種成分含量變化（±s，μg/g，n=3）Tab.3 Content changes of five components in Curcuma wenyujin before and after processing with vinegar（±s，μg/g，n=3）

時間醋制前醋制后莪術烯醇0.055 1±0.000 7 0.045 8±0.001 1莪術二酮2.077 0±0.012 1.995 0±0.014莪術醇0.092 8±0.001 8 0.084 1±0.002 2吉馬酮0.615 4±0.001 4 0.586 0±0.002 1 β ?欖香烯0.433 1±0.002 1 0.405 7±0.001 5

3 討論

莪術烯醇、莪術二酮、莪術醇、吉馬酮、β?欖香烯是溫郁金中的主要有效成分，均為倍半萜類化合物，主要分布于揮發油成分中并可以發揮抗腫瘤、抗血栓、抗炎功效，5 種成分分離度均大于1.5，且5 種有效成分進樣量與峰面積間均存在良好的線性關系。因此，本研究中選此5 種成分為溫郁金藥材醋制前后成分變化的檢測指標。

吉馬酮、莪術醇等具有1，5 ?二烯結構化合物若采用常用的氣相色譜法、氣相色譜?質譜聯用法檢測，在色譜柱高溫條件下會造成揮發油活性成分重排、轉化并產生數據偏差，影響數據的真實性與可參考價值［4］。HPLC 法是檢測有效成分的常用技術之一，具有準確度高、檢測速度快等多項優勢［5］。本研究結果顯示，采用HPLC法檢測溫郁金飲片中5種有效成分，其精密度、穩定性及重復性均較好，且具有較高的適用性。因此，本研究中選用HPLC 法檢測溫郁金藥材/ 飲片有效活性成分的變化情況。

酯類物質是醋中的主要成分，酯類、醇類物質在醋制加熱條件下與溫郁金藥材/飲片中的活性成分相互作用，進而導致溫郁金中成分含量的升高或降低［6］。溫郁金藥材醋制前后的藥效功能各有所倚重，生溫郁金長于行氣解郁、清心涼血，醋制后主入肝經，尤善于散瘀止痛。本研究中醋制后溫郁金飲片的莪術烯醇、莪術二酮、莪術醇、吉馬酮、β?欖香烯含量均降低，其中莪術二酮降低最顯著。童黃錦［7］的研究表明，溫郁金藥材醋制后能增強其對血小板聚集、疼痛因子、改善血液循環等藥效學指標的調節控制作用。溫郁金藥材醋制前后β?欖香烯、吉馬酮等成分含量減少而其療效反而增強，其原因為中藥炮制加工及輔料會影響各成分在體內的轉化過程，進而導致藥效學存在差異，因此溫郁金藥材醋制后可增強散瘀止痛療效［8?10］。但本研究的結果與部分文獻結果存在一定差異，其原因可能是選取的溫郁金藥材產地不同，其受到土壤養分、水質、光照等地域因素影響導致活性成分含量不同，因此醋制前后的成分變化情況存在差異，后續可針對不同產地的溫郁金醋制前后成分變化情況進行深入研究。本研究中莪術烯醇、莪術二酮、莪術醇、吉馬酮、β?欖香烯含量降低，可能是由于加工工藝不完善，導致有效成分流失，后續應將溫郁金藥材醋制工藝優化作為重點發展方向之一。

綜上所述，本研究中建立的檢測溫郁金藥材醋制加工前后莪術二酮、莪術醇、莪術烯醇、吉馬酮、β?欖香烯含量變化的HPLC 法，具有檢測速度快、重復性良好和穩定性高等優勢，可對溫郁金藥材醋制加工進行質量控制。醋制是提升溫郁金飲片有效成分的良好方案，可作為溫郁金藥材產地規范化加工發展的參考方向，但應進一步優化此工藝，同時避免加工過程中溫郁金飲片有效成分的流失。