伊曲康唑膠囊有關物質測定方法優化*

張秉華，杜亞俊，衷紅梅，牛龍青，趙蒲中

（陜西省食品藥品檢驗研究院，陜西 西安 710065）

伊曲康唑為三唑類抗真菌藥物，主要通過干擾真菌細胞膜麥角固醇的生物合成來抑制真菌增殖、促進真菌死亡，具有抗菌譜廣、毒性低的特點，臨床適用于淺表真菌感染和深部真菌引起的系統感染，及其他抗真菌藥物不適用或無效的系統性感染［1?4］。伊曲康唑膠囊為我院2021年國家評價性抽驗品種，抽驗執行2015年版《中國藥典（第一增補本）》［5］和2020 年版《中國藥典（二部）》［6］中有關物質檢查方法。在實際檢驗中發現，系統適用性溶液制備困難，難以達到系統適用性要求；部分樣品相鄰雜質峰分離效果欠佳，影響結果。查閱文獻［7］發現，藥典中有關物質檢測方法為2010 年前起草，雜質E峰的相對保留時間可能存在偏差，企業反映該相對保留時間的雜質峰無法通過強制降解試驗得到，造成在未達到系統適用性要求的情況下開展檢驗。此外，隨著伊曲康唑生產工藝的變化和對其雜質譜研究的深入，藥典中相關物質檢測方法僅對單個雜質和雜質總量進行控制，難以真實反映各企業的產品質量。本研究中采用高效液相色譜法對現行有關物質檢測方法進行改進，以期建立靈敏度高、分離效果好、檢測效率高、對環境友好的測定方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、Shimadzu LC ?2030 3D 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；XPE205 型、ME204 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Milli ?Q 高純水機（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

伊曲康唑對照品（批號100631 ?201402，含量99.2%）、雜質A 對照品（批號130686 ?201501，含量99.5%）、雜質B 對照品（批號130687 ?201501，含量97.5%）、雜質C 對照品（批號130688 ?201501，含量96.3%）、雜質D 對照品（批號130689 ?201501，含量95.1%）、雜質E 對照品（批號130690 ?201501，含量97.1%）、雜質F 對照品（批號130691 ?201501，含量98.0%）、雜質G 對照品（批號130692 ?201501，含量95.5%），均購自中國食品藥品檢定研究院；伊曲康唑雜質H 對 照 品（企 業D，批 號WVLA_0062_003_1，含 量97.2%）。伊曲康唑膠囊為2021年國家評價性抽驗樣品，此次抽樣涉及A，B，C，D 4個生產企業，各3批。原輔料為生產企業A，B，C提供；四氫呋喃、甲醇、乙腈均為色譜純，四丁基硫酸氫銨、乙酸銨均為分析純，水為高純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Aglient Proshell 120 EC ?C18柱（150 mm ×4.6 mm，2.7 μm）；流動相：0.01 mol/L乙酸銨溶液（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min 時62%A，3～6 min 時62%A→45%A，6～11 min 時45%A；11～19 min 時45%A→34%A，19～36 min 時34%A；36～38 min 時34%A→62%A，38～40 min時62%A）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

稀釋劑：稀釋劑Ⅰ為甲醇?乙腈（3∶1，V/V）；精密量取稀釋劑Ⅰ700 mL，加0.01 mol / L 乙酸銨溶液300 mL，混勻，即得稀釋劑Ⅱ。

對照品溶液：取雜質B 對照品0.012 79 g、雜質F 對照品0.0129 2 g、雜質G 對照品0.011 98 g，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加稀釋劑Ⅰ70 mL 使溶解，加稀釋劑Ⅱ定容，搖勻，即得雜質B，F，G 的混合對照品溶液。取雜質H對照品0.004 30 g，精密稱定，置20 mL容量瓶中，加稀釋劑Ⅰ14 mL 使溶解，加稀釋劑Ⅱ定容，搖勻，即得雜質H 對照品溶液。分別取雜質A 對照品、雜質B對照品、雜質C 對照品、雜質D 對照品、雜質E 對照品、雜質F對照品、雜質G對照品、雜質H對照品約12 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加稀釋劑Ⅰ70 mL使溶解，再加稀釋劑Ⅱ定容，搖勻；精密量取1 mL，加入伊曲康唑對照品40 mg，置100 mL容量瓶中，加稀釋劑Ⅰ70 mL使溶解，再加稀釋劑Ⅱ定容，搖勻，制成每1 mL中含各雜質1.2 μg和含伊曲康唑0.4 mg的混合對照品溶液。

供試品溶液：取伊曲康唑膠囊內容物適量（約相當于伊曲康唑100 mg），精密稱定，置250 mL容量瓶中，加稀釋劑Ⅰ175 mL 使溶解，加稀釋劑Ⅱ定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

對照溶液：精密量取供試品溶液1 mL，置25 mL容量瓶中，加稀釋劑Ⅰ17.5 mL，加稀釋劑Ⅱ定容，搖勻；精密量取1 mL，置20 mL容量瓶中，加稀釋劑Ⅰ14 mL，加稀釋劑Ⅱ定容，搖勻，即得。

陰性對照品溶液：按輔料用量最多的生產企業的處方工藝及比例制備缺伊曲康唑的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別取2.2項下混合對照品溶液和陰性對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。可見，雜質C與雜質D為異構體，保留時間相同，其余各峰之間分離度均大于1.5，且陰性對照無干擾。詳見圖1。

線性關系考察：分別取伊曲康唑、雜質B 對照品、雜質C 對照品、雜質D 對照品、雜質F 對照品、雜質G 對照品、雜質H 對照品適量，精密稱定，加入70%體積的稀釋劑Ⅰ使溶解，再加入稀釋劑Ⅱ定容，倍比稀釋，制成質量濃度分別為0.3，0.6，1.2，1.8，2.4 μg/mL 的系列混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度（X，μg/ mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，以斜率計算相對校正因子。結果見表1。

1.雜質H 2.雜質A 3.雜質B 4.雜質C（或雜質D） 5.雜質E 6.伊曲康唑 7.雜質F 8.雜質GA.混合對照品溶液 B.陰性對照品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Impurity H 2.Impurity A 3.Impurity B 4.Impurity C/D 5.Impurity E 6.Itraconazole 7.Impurity F 8.Impurity GA.Mixed reference solution B.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

表1 線性關系考察結果（n=5）Tab.1 Results of the linear relation test（n=5）

定量限與檢測限考察：取線性關系考察項下的系列混合對照品溶液，倍比稀釋，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以信噪比為3∶1 和10∶1 時的質量濃度分別作為檢測限和定量限。結果伊曲康唑、雜質B、雜質C、雜質D、雜質F、雜質G、雜質H 的檢測限分別為0.38，0.37，0.35，0.37，0.38，0.57，1.25 ng，定量限分別為1.27，1.25，1.16，1.23，1.27，1.37，3.76 ng。

重復性試驗：取企業D 同一批樣品適量，共6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。由于樣品中單個雜質含量較低（均小于0.05%），6 份樣品中單個雜質含量測定結果的RSD均小于3.85%，雜質總量的RSD為0，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：參考歐洲藥典和美國藥典相關標準及文獻［8］，以0.3%為各雜質限度，制備樣品中檢出率較高的雜質B、雜質F、雜質G、雜質H 的回收率溶液。稱取各雜質含量已知的同一批樣品適量（約相當于伊曲康唑100 mg），精密稱定，置250 mL容量瓶中，分別加入雜質B，F，G 的混合對照品溶液和雜質H 對照品溶液適量，制成雜質含量分別為0.12%，0.3%，0.5%的溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率［9］。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品檢測

取4個企業的12批樣品適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別加入對照溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并采用主成分自身對照法計算雜質B，C，D，F 和其他單個雜質含量，雜質G 和雜質H含量按加校正因子的主成分自身對照法計算，含量低于0.05%的雜質忽略不計。結果見表3。

表3 伊曲康唑膠囊有關雜質檢測結果（%）Tab.4 Results of content determination of related substance in Itraconazole Capsules（%）

2.5 不同測定方法結果比較

采用藥典［5?6］中有關物質檢查方法，對4 個企業同批號的12 批樣品進行含量測定，并與本研究中新建方法結果進行比較。結果表明，2 種方法檢測的企業B，C，D 樣品含量的結果基本一致，采用新建方法測得企業A 3 批樣品的雜質總量（0.31%，0.43%，0.21%）高于藥典中的方法（0.25%，0.28%，0.15%）。比較企業A 同批號樣品色譜圖（圖2）發現，新建方法的雜質檢出個數更多。

1.雜質B 2.質雜C和D 3.雜質F與未知雜質 4.未知雜質5.雜質H 6.雜質GA.現行標準方法（主藥質量濃度2 mg/mL） B.新建方法（主藥質量濃度0.4 mg/mL）圖2 不同方法測定同批號伊曲康唑膠囊有關物質色譜圖1.Impurity B 2.Impurity C/D 3.Impurity F and unknown impurity 4.Unknown impurity 5.Impurity H 6.Impurity GA.Current standard method（the mass concentration of main drug is 2 mg/mL） B.New method（the mass concentration of main drug is 0.4 mg/mL）Fig.2 Chromatograms of related substances in Itraconazole Capsules with same batch number determined by different methods

3 討論

3.1 檢測波長選擇

預試驗中對混合對照品溶液和供試品溶液進行全波長掃描，發現伊曲康唑、雜質A～G 在（260 ± 2）nm波長處、雜質H 在（248 ± 2）nm 波長處有最大吸收峰，為保證多數雜質的檢出靈敏度，選擇260 nm 作為檢測波長。

3.2 耐用性考察

取混合對照品溶液和供試品溶液，通過更換不同型號高效液相色譜儀（Agilent 1260 型、島津LC2030C 3D 型），不同色譜柱［Aglient Proshell 120 EC ?C18柱（150 mm × 4.6 mm，2.7 μm）、Welch Boltimate EXT ?C18柱（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）］，以及改變柱溫（±3 ℃），各雜質均可有效分離，表明方法耐用性良好。

3.3 出峰情況

藥典中有關物質檢測采用甲酸破壞法制備系統適用性溶液，檢驗中發現主峰前后的雜質峰難以強制降解得到，生產企業均反映受此問題困擾。本研究中嘗試多種方法制備系統適用性溶液效果均不佳，建議采用雜質C（或雜質D）、雜質E、伊曲康唑、雜質F 制備系統適用性溶液，雜質C（或雜質D）峰與雜質E峰、伊曲康唑峰與雜質F峰分離度應符合要求。

綜上所述，本研究前期對4 個生產企業131 批樣品的雜質進行含量測定，結果雜質B、雜質F、雜質G、雜質H 的檢出率較高，故本研究中主要對這4 種雜質的含量測定進行方法學考察。結果顯示，所建有關物質檢測方法靈敏度高、分離效果好，運行時間短，流速低，有機溶劑用量少，對環境更友好，可滿足4 個生產企業的伊曲康唑膠囊產品質量控制要求。