血紅素加氧酶-1降低RAW264.7巨噬細胞炎癥因子表達的線粒體機制研究

高新躍, 馮羽敬, 包 蓉, 黃朝朝, 貢 瞻, 周宇杰

(上海市浦東新區浦南醫院 麻醉科, 上海, 200125)

炎癥是機體抵御外來病原體感染發生各種病理反應的中心環節，會造成組織細胞損害[1]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)主要由單核巨噬細胞分泌，可誘導炎癥級聯反應和巨噬細胞表達白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)，在免疫細胞功能調節中有重要作用，其中IL-1β是反映全身和局部炎癥反應的重要物質[2]。相關研究[3]表明，過度的炎癥反應會導致線粒體功能受損，生成大量活性氧(ROS), 加重炎癥反應，嚴重時還會導致線粒體凋亡和細胞死亡。血紅素加氧酶-1(HO-1)是體內重要的誘導型抗氧化酶，正常情況下表達極少，在內毒素脂多糖(LPS)、炎癥因子、ROS等刺激下可大量表達[4]。相關研究[5-7]發現, RAW264.7巨噬細胞可表達HO-1, 抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的釋放。但HO-1抑制炎癥反應是否與線粒體功能有關目前尚未完全闡明，鑒于此，本研究分析了HO-1抑制TNF-α、IL-1β、ROS合成與線粒體分裂的關系，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

RAW264.7巨噬細胞(批號FH0318), 購自富衡生物科技有限公司; LPS(批號HY-D1056)、HO-1誘導劑血紅素(Hemin, 批號HY-19424)、HO-1拮抗劑鋅原卟啉-IX(ZnPP-IX, 批號HY-101193)、線粒體自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA, 批號HY-19312)、線粒體自噬促進劑雷帕霉素(RAPA, 批號AY-22989), 購自美國NCE生物公司; HO-1抗體(批號AF5393)、IL-1β抗體(批號AF5103)、TNF-α抗體(批號AF7014)、購自中國Affinity生物公司; 自噬標志物微管相關蛋白1A/1B輕鏈3B(LC3B, 批號AF5402), 購自美國Proteintech生物公司; ROS檢測試劑盒(批號S0033S)、Western及IP細胞裂解液(批號P0013)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量分析試劑盒(增強型)(批號P0010)，購自中國碧云天生物技術公司。

1.2 實驗分組與處理

取對數生長期的RAW264.7細胞進行培養，將其隨機分為空白對照組(C組)、LPS造模組(CL組)、Hemin+LPS組(HL組)、ZnPP-IX+LPS組(ZL組)、3-MA+LPS組(ML組)、RAPA+LPS組(RL組)，共計6組。C組: 繼續培養，不做任何處理; CL組: 加入1 μg/mL LPS孵育; HL組: 加入30 mol/L Hemin孵育1 h后，加入1 μg/mL LPS孵育; ZL組: 加入5 μmo1/L ZnPP-IX孵育0.5 h后，加入1 μg/mL LPS孵育; ML組: 加入5 mmo1/L 3-MA孵育0.5 h后，加入1 μg/mL LPS孵育; RL組: 加入12.5 nmo1/L RAPA孵育0.5 h后，加入1 μg/mLLPS孵育。各組于培養后LPS孵育48 h后，進行相關指標的測定。

1.3 蛋白質印跡法(Western blot)檢測蛋白表達量

采用凝膠電泳法進行HO-1、IL-1β、TNF-α、線粒體動力蛋白1(DRP1)、受體裂變蛋白1(FIS1)、LC3B、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)檢測，使用Image J軟件分析各組目標條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值代表HO-1、IL-1β、TNF-α、LC3B、FIS1、DRP1的表達量。

1.4 ROS檢測

使用ROS檢測試劑盒進行測定，采用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照，以Image J 軟件分析ROS含量。

1.5 統計學分析

2 結 果

與C組比較，另5組的HO-1、LC3B、ROS表達量均增加, DRP1表達量均降低，差異有統計學意義(P<0.05); 與C組比較, CL組、ZL組和ML組的FIS1表達量均增加, HL組、RL組的FIS1表達量均降低，差異有統計學意義(P<0.05); 與C組比較, HL組的IL-1β、TNF-α表達量均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與CL組比較, HL組的LC3B表達量降低, ZL組、ML組和RL組的LC3B表達量均增加，差異有統計學意義(P<0.05); 與CL組比較，HL組的TNF-α、IL-1β表達量均降低, RL組的IL-1β表達量增加、TNF-α表達量降低, ML組的TNF-α、IL-1β表達量增加，差異有統計學意義(P<0.05); 與CL組比較, HL組、RL組的ROS表達量降低, ZL組、ML組的ROS表達量增加，差異有統計學意義(P<0.05)。HL組的TNF-α、IL-1β、DRP1表達量低于另5組, HO-1表達量高于另5組，差異有統計學意義(P<0.05); RL組的FIS1表達量低于HL組, LC3B表達量高于HL組，差異有統計學意義(P<0.05)。RL組的IL-1β、TNF-α、FIS1、DRP1、ROS表達量低于ML組, LC3B表達量高于ML組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 6組HO-1、IL-1β、TNF-α、LC3B、FIS1、DRP1和ROS表達量比較

3 討 論

控制過度的炎癥反應，對于減少炎癥相關疾病和組織細胞損傷意義重大[8]。本研究中，實驗采用的RAW264.7巨噬細胞是目前檢測抗炎癥反應影響的最常用細胞[9]。離體實驗和在體研究[10-11]證明, Hemin作為一種活性蛋白，可誘導HO-1大量表達，生成有活性的代謝物質和重要的分子信號通路，顯著提高細胞和機體的存活率。本研究結果顯示，與C組、CL組、ZL組比較，HL組HO-1表達量增加, IL-1β、TNF-α、ROS表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05), 表明HO-1大量表達可減輕炎癥反應和氧化應激，與相關研究[12]結論一致。

線粒體自噬是維持細胞內環境穩定的重要機制之一，可以消滅各種外來有害物質和抑制氧化應激、炎癥反應、衰老和死亡等，其重要標志是細胞內出現自噬小體[13]。線粒體功能改變，往往表現為DRP1和FIS1增加。線粒體動力學平衡，包括分裂/融合平衡[14]。相關研究[15]指出，FIS1作為一種重要的受體，可協助DRP1完成裂變事件。本研究結果顯示, RL組LC3B表達量高于C組、CL組、ML組, FIS1、DRP1表達量低于C組、CL組、ML組, IL-1β、TNF-α表達量低于ML組, ROS表達量低于CL組、HL組、ML組，差異有統計學意義(P<0.05), 表明線粒體自噬有利于減輕氧化應激和炎癥反應。本研究還發現, HL組的FIS1表達量低于ML組、高于RL組，差異有統計學意義(P<0.05), 說明HO-1可以抑制線粒體分裂。

相關研究[14]證明, HO-1可抑制炎癥反應和氧化應激，調節線粒體分裂/融合平衡過程，減少細胞凋亡的發生。本研究發現，HO-1和線粒體自噬均有利于減輕炎癥反應和氧化應激，說明HO-1有保護線粒體功能的作用。

綜上所述, HO-1可抑制線粒體分裂而降低炎癥因子表達，且效果優于線粒體自噬。但本研究僅觀察了FIS1的變化，并未綜合研究分裂/融合平衡的變化，說服力可能較弱，且僅從HO-1抑制LC3B、FIS1表達方面難以證明HO-1可以調節線粒體功能，進而抑制炎癥反應，未來還需進一步深入研究。