黃芪桂枝五物湯防治深靜脈血栓形成模型大鼠的實驗研究

臧 鵬, 李進霞, 李 吉, 張慧芝, 谷 艷

(1. 山西省大同市第三人民醫院 普通外科, 山西 大同, 037000;2. 山西大同大學醫學院, 山西 大同, 037009)

深靜脈血栓形成(DVT)是指血液在深靜脈內異常凝結而阻塞血液回流，并引起靜脈壁的炎性改變，是臨床上常見的周圍血管疾病。DVT好發于下肢，多見于高齡、制動、手術、創傷、惡性腫瘤、產后、口服避孕藥等人群中。據研究[1-4]統計，血管疾病中DVT的發病率僅次于急性冠狀動脈綜合征、腦卒中，是第三大常見的血管疾病。中國有關DVT確切發病機制的文獻報道較少，但隨著中國居民生活水平的提高、人均壽命的延長，中國DVT的發病率有逐年升高的趨勢[5-7]。若DVT患者得不到及時、有效的治療，則可能會進展為血栓形成后綜合征或血栓脫落導致肺栓塞，進而危及生命。

DVT屬中醫“股腫”范疇，脈絡血瘀濕阻是其主要的病因病機，根據患者的臨床分型可采用補氣活血、溫補脾腎、清熱利濕的中藥復方進行治療[8]。黃芪桂枝五物湯是由黃芪、桂枝、芍藥、生姜、大棗5味中藥配伍而成，是治療血痹的常用方劑。趙志麗等[9]運用黃芪桂枝五物湯辨治肺癌下肢靜脈栓塞癥，不僅顯著改善了患者的臨床癥狀，而且極大地縮短了深靜脈血栓急性期、亞急性期病程。戴越保[10]發現黃芪桂枝五物湯可以有效地預防膝關節置換術后DVT, 且效果優于利伐沙班，具有良好的安全性。本研究采用黃芪桂枝五物湯干預DVT模型大鼠，觀察其對模型大鼠凝血指標、血漿代謝產物以及血栓形成段組織形態學的影響，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取40只無特定病原體(SPF)級SD大鼠，雄性，體質量180～220 g, 購自蘇州西山生物技術有限公司，許可證號為SCXK(京)2019-0010。將大鼠適應性飼養1周后，隨機分為假手術組、模型組、黃芪桂枝五物湯給藥組(中藥組)及低分子量肝素鈣陽性對照組(肝素鈣組)，每組10只。

1.2 藥品及黃芪桂枝五物湯凍干粉制備

黃芪、桂枝、芍藥、生姜、大棗均購自北京同仁堂大同連鎖藥店有限責任公司，由山西大同大學中醫藥健康服務學院柴茂山教授鑒定。低分子量肝素鈣(萬力舒，煙臺東誠北方制藥有限公司，國藥準字H20153196)。按黃芪桂枝五物湯處方比例稱取黃芪15 g、桂枝12 g、芍藥12 g、生姜25 g、大棗4枚，加10倍量的水浸泡30 min, 煎煮1 h后倒出煎煮液; 再次加入8倍量的水復煎30 min, 合并2次煎煮液，經5層紗布過濾后冷凍干燥，即得凍干粉，得率約為20%。

1.3 主要試劑與儀器

氯化鈉(SOLARBIO公司, CAS號: 7647-14-5), 大鼠D-二聚體ELISA試劑盒(酶免, MM-0623R1), 蘇木素染液(中杉金橋, ZLI-9610), 伊紅染色液(Solarbio, G1100), 超凈高級封片膠(BASO, YZB), Scott藍化液(Solarbio, G1865); 微量注射泵(kd Scientific, LEGATO 130), 凝血儀(廣州萬孚, NX-102), 臺式離心機(Eppendorf, 5424R), 酶標儀(北京六一, WD-2102B), 顯微鏡(OLYMPUS, CX41), 切片機(Leica, 2235), 超高效液相色譜(Thermo Fisher Scientific, Vanquish), 高分辨質譜(Thermo Fisher Scientific, Q Exactive HFX)。

1.4 造模與給藥

模型組、中藥組及肝素鈣組均參照文獻[11]構建不完全結扎的大鼠股靜脈血栓模型，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg/kg), 待麻醉生效后，剃去大鼠腹股溝處鼠毛并消毒皮膚; 沿左腹股溝區中點做2 cm縱行切口，分離左股靜脈，在左股靜脈近心端處繞絲線行不完全結扎，使血管腔縮小約1/2以減慢血流; 從左股靜脈遠心端緩慢注入10%高滲鹽水0.4 mL, 此時可觀察到股靜脈變為暗紅色，提示血栓形成; 檢查周圍組織無出血后縫合切口，外敷消毒紗布[11]。假手術組不結扎、不給予高滲鹽水刺激，其余操作同模型組。中藥組給予藥物凍干粉溶液2.0 g/(kg·d), 按每100 g為1 mL的比例灌胃; 肝素鈣組給予低分子量肝素鈣351.43 IU/(kg·d), 按每100 g為0.1 mL的比例皮下注射; 假手術組、模型組均以每100 g為1 mL的蒸餾水灌胃，各組大鼠給藥時間均為造模前7 d至造模后7 d, 給藥1次/d, 持續給藥14 d。

1.5 樣本采集與檢測

治療結束后的第1天，將各組大鼠用5%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈取血，置于冷水浴冷卻的肝素抗凝管中，混勻，4 ℃下3 000 轉/min離心10 min, 分離血漿并保存于-80 ℃冰箱中; 經原切口取出各組大鼠股靜脈血栓段。將各組大鼠股靜脈段進行常規固定、包埋、切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察各組大鼠局部血栓形成靜脈段組織形態學的差異。采用凝血儀及原裝配套試劑檢測各組大鼠血中活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)以及纖維蛋白原(FIB)水平; 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血中D-二聚體(D-D)水平。血漿代謝產物檢測流程: 取血漿100 μL, 加入400 μL提取液[甲醇∶乙腈=1∶1的體積比(V/V)], 渦旋混合30 s, 12 000轉/min離心15 min, 取上清液進行液相色譜-質譜(LC-MS)分析。

1.6 統計學分析

2 結 果

2.1 各組大鼠行為學比較

造模前7 d時，各組大鼠精神狀況良好，四肢活動及飲食正常。造模后，假手術組大鼠精神狀態良好，左下肢無明顯腫脹，行動無明顯受限; 其他3組大鼠造模后精神狀況一般，左下肢明顯腫脹、青紫，活動減少。持續給藥7 d后，肝素鈣組、中藥組大鼠較模型組大鼠精神狀態明顯好轉，左下肢血運明顯改善，食欲增加，提示低分子量肝素鈣和黃芪桂枝五物湯均能改善DVT大鼠的一般狀態。

2.2 各組大鼠凝血指標比較

與假手術組比較，模型組大鼠FIB及D-D水平均升高, APTT、PT、TT均縮短，差異有統計學意義(P<0.05), 說明DVT大鼠體內處于高凝狀態，容易產生血栓; 與模型組比較，肝素鈣組、中藥組FIB及D-D水平均下降, APTT、PT、TT均延長，差異有統計學意義(P<0.05), 說明低分子量肝素鈣和黃芪桂枝五物湯均能增強大鼠體內的抗凝系統功能; 與肝素鈣組比較，中藥組D-D水平更低，差異有統計學意義(P<0.05), 說明黃芪桂枝五物湯對D-D的調節作用更為顯著。見表1。

表1 各組大鼠凝血指標比較

與假手術組比較, *P<0.05; 與模型組比較, #P<0.05; 與肝素鈣組比較, △P<0.05。

2.3 黃芪桂枝五物湯對DVT大鼠代謝紊亂的調節作用

對假手術組與模型組的血漿代謝產物進行單元統計分析，結果發現2組間共有27個變量存在統計學差異(篩選條件為fold change≤0.5或fold change≥2, 同時P<0.05), 這些差異代謝物反映了DVT大鼠的代謝紊亂情況。計算差異代謝物在中藥組及肝素鈣組中的均值，找尋各給藥組中向假手術組有恢復趨勢的代謝產物，并與模型組進行獨立樣本t檢驗分析。結果表明，治療14 d后，黃芪桂枝五物湯可以使14種差異代謝物的水平趨向假手術組恢復，主要涉及改善維生素K、三甲基胺氮氧化物(TMAO)、鵝肌肽、L-肌肽、肉堿代謝、膽汁酸代謝和脂代謝等; 低分子量肝素鈣可以使8種差異代謝物的水平趨向假手術組恢復，主要涉及TMAO、鵝肌肽、L-肌肽、肉堿代謝以及氨基酸代謝等。上述結果說明黃芪桂枝五物湯可以更全面地改善DVT大鼠的代謝異常。見表2。

表2 各組大鼠差異代謝物水平比較

2.4 各組大鼠靜脈血栓段的組織形態學差異

假手術組靜脈管腔中無血栓形成，管腔結構完整，內皮細胞排列整齊，管壁無水腫及炎性浸潤; 模型組中靜脈管腔被血栓填塞，管壁水腫增厚，內膜不規則，可見內皮細胞脫落，靜脈壁與血栓粘連，炎性細胞浸潤較為嚴重; 肝素鈣組靜脈管腔內部分血栓崩解，部分血栓收縮，血栓與靜脈壁可見局限性粘連，血管內皮細胞可見部分脫落，靜脈壁水腫及炎性細胞浸潤較模型組輕; 中藥組靜脈管腔內血栓大部分崩解消失，殘留少量血栓收縮，腔內再通明顯，血栓與靜脈壁無明顯粘連，管壁結構較完整，內皮細胞脫落較少，管壁炎性細胞浸潤較輕。見圖1。

A、B: 假手術組; C、D: 模型組; E、F: 肝素鈣組; G、H: 中藥組。A、C、E、G放大倍數為100倍, B、D、F、H放大倍數為400倍。圖1 各組大鼠靜脈血栓的組織形態學差異(HE染色)

3 討 論

DVT是臨床上常見的周圍血管疾病之一，是血液在下肢深靜脈內異常凝結引起的靜脈回流障礙性疾病，屬于臨床急危重癥。目前，除導管溶栓、吸栓等介入手術外，藥物溶栓和抗凝是DVT的主要治療方法，可以有效抑制血栓的擴展，降低肺栓塞和血栓后綜合征的發生率[13]。然而，西藥在抗凝和溶栓的同時易引發出血等不良反應，例如胃腸出血、硬膜外血腫、腹膜后血腫等[14-16]; 肝素類抗凝藥則必須靜脈或皮下注射給藥，操作繁瑣; 口服抗凝藥華法林的治療效果易受多種食物和藥物的影響; 利伐沙班(新型凝血因子抑制劑)的價格比較昂貴，在一定程度上限制了臨床應用。

DVT屬中醫“股腫”范疇，脈絡血瘀濕阻是該病的主要病機; 中醫學認為氣為血帥，氣傷則血行不暢，氣不暢則血行緩慢，以致瘀血阻于脈中。黃芪桂枝五物湯由黃芪、桂枝、芍藥、生姜、大棗5味中藥配伍而成，具有益氣通經、活血通絡之功效，可以有效防治DVT。凝血四項包括APTT、PT、TT以及FIB, 是臨床上常用的檢測凝血功能的指標，對疾病診斷具有重要的意義。APTT主要反映內源性凝血系統狀況, PT主要反映外源性凝血系統狀況, TT及FIB反映纖維蛋白原是否正常。APTT、PT、TT縮短提示機體處于高凝狀態，容易發生血栓栓塞性疾病; 血漿FIB是纖維蛋白的前體，在凝血的最后階段，可溶性纖維蛋白原轉變為不溶性纖維蛋白，從而使血液凝固，FIB水平升高提示機體的凝血系統活性可能增強。

D-D是交聯纖維蛋白的特異性降解產物之一，是繼發性纖維蛋白溶解亢進的特有代謝產物。D-D水平與血栓的大小及活動性相關，發生下肢DVT的同時纖溶系統也被激活，血液中D-D水平升高[17], 因此D-D是下肢DVT的常用輔助診斷指標。本研究中，模型組大鼠APTT、PT、TT均顯著縮短，而FIB、D-D顯著升高，說明DVT模型大鼠體內存在高凝狀態和繼發性纖維蛋白溶解亢進。DVT模型大鼠經黃芪桂枝五物湯治療后，APTT、PT、TT均顯著延長，而血漿FIB、D-D水平均顯著降低，且D-D水平較肝素鈣組下降更為顯著，說明黃芪桂枝五物湯具有顯著的抗凝作用，可改善機體的高凝狀態。

針對血漿代謝產物的分析發現，模型組中維生素K水平較假手術組顯著升高，而維生素K具有促進凝血的作用，說明模型組大鼠處于高凝狀態，而黃芪桂枝五物湯可能通過抑制DVT大鼠維生素K的吸收來下調維生素K水平，從而改善DVT大鼠的高凝狀態。研究[18]報道TMAO可以促進動脈粥樣硬化性血栓的形成，本研究發現模型組TMAO水平較假手術組顯著升高，印證了TMAO與血栓形成的關聯性，而黃芪桂枝五物湯可以顯著下調TMAO水平。此外，與低分子量肝素鈣相比，黃芪桂枝五物湯可以顯著改善DVT大鼠體內的鵝肌肽、L-肌肽、肉堿代謝、膽汁酸代謝和脂代謝，說明中藥對DVT的治療效果更為全面。

本研究還通過組織形態學方法直觀地觀察了局部血管及血栓狀態。本研究發現，模型組大鼠靜脈管腔被血栓填塞，管壁水腫增厚，內膜不規則，可見內皮細胞脫落，靜脈壁與血栓粘連，炎性細胞浸潤較為嚴重; 肝素鈣組靜脈管腔內部分血栓崩解，部分血栓收縮，血栓與靜脈壁可見局限性粘連，血管內皮細胞部分脫落，靜脈壁水腫及炎性細胞浸潤較模型組輕; 中藥組靜脈管腔內血栓大部分崩解消失，殘留少量血栓收縮，腔內再通明顯，血栓與靜脈壁無明顯粘連，管壁結構較完整，內皮細胞脫落較少，管壁炎性細胞浸潤較輕。組織形態學結果證實了黃芪桂枝五物湯具有保護血管內皮細胞、抑制血栓形成、減少炎細胞浸潤等作用。

綜上所述，黃芪桂枝五物湯具有抗凝、改善代謝紊亂、抑制血栓形成、保護血管內皮細胞以及減輕炎性細胞浸潤等作用，這可能是其治療DVT的重要機制。