提高乳桿菌屬冷凍干燥存活率研究進展

寇佳祥，喬建軍,，朱宏吉*，吳昊，張悅

1(天津大學 化工學院，天津，300072)2(天津大學 浙江紹興研究院，浙江 紹興，312300)

2014年6月10日，國際益生菌和益生元科學協會在NatureReviewsGastroenterology&Hepatology雜志上發表文章，系統介紹了益生菌的定義和范圍[1]。文章肯定了FAO/WHO 在2001年對益生菌的定義，即當食用足夠數量時，對所在宿主產生健康益處的活性微生物。對益生菌如何更好地發揮益生作用以及如何更好地被應用于食品、保健品當中，正在成為營養科學、合成生物學、食品科學等學科深度融合及學科交叉發展的熱點領域。乳桿菌是目前開發研究較為深入的一類重要的益生菌[2]，是人類腸道中重要的生理菌，在食品開發方面有廣闊的市場空間，但菌株在產品開發及應用過程中容易受到外界溫度、壓力、含氧量等不利因素的影響，導致乳桿菌存活率降低，影響乳桿菌的生理活性[3]，這是影響乳桿菌在食品方面更深層應用的一大障礙。通過冷凍干燥技術能夠獲得具有長期保持細胞活力和穩定性的乳桿菌菌粉，并且對細菌損傷較小，但在凍干過程中細胞仍然會受到胞外冰晶的形成和由此導致的滲透壓的增加對細胞的損害，因此研究人員針對如何增強乳桿菌的抗凍能力，進而提高乳桿菌的冷凍干燥存活率做了許多研究。如乳桿菌菌粉制備工藝流程(圖1)所示，培養基優化、脅迫預處理、添加凍干保護劑、優化預冷凍條件這4方面是影響菌株凍干存活率的關鍵環節，本文從這4方面總結了提高乳桿菌凍干存活率的最新研究進展。

圖1 乳桿菌菌粉制備工藝流程圖Fig.1 Process flow chart for preparation of Lactobacillus powder

1 優化培養基組成提高乳桿菌的凍干存活率

1.1 優化培養基增強乳桿菌生理活性

乳桿菌的體外培養離不開培養基，培養基是通過添加各種適合微生物生長所需要的營養物質得到的混合物，包括碳源、氮源、無機鹽、金屬離子和水等[4]。常規的MRS培養基能夠滿足絕大多數乳桿菌的正常培養，但在冷凍干燥前需要培養出生理活性更強的乳桿菌，才能更好地抵抗真空冷凍干燥過程對菌株的損傷。通過優化培養基中各成分的比例，可以更好地保護乳桿菌中參與能量代謝的關鍵酶，如β-半乳糖苷酶、Na+K+-ATP酶和乳酸脫氫酶的活力，從而增強菌株的生理活性[5]。優化培養基比例可使菌株生理活性增強，生長能力就越強，通過高密度培養就會產生越多菌株，李娜等[6]通過響應面實驗優化了MRS培養基組成及比例，蔗糖43 g/L、玉米漿干粉60 g/L、Na2HPO4-檸檬酸0.12 mol/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L、MnSO4·H2O 0.10 g/L、吐溫80 1 m L/L時，植物乳桿菌ZJ316活菌數比常規培養基提高了3.44倍。CHOI等[7]通過優化MRS培養基比例，提高了植物乳桿菌200665的生長能力，在相同時間內產生的菌種量是常規培養基的1.58倍。此外，研究人員還開發了新型培養基，LIEWSKA等[8]開發了以小麥、玉米、大麥和黑麥粉為原料的培養基，使鼠李糖乳桿菌有更好的生理活性，其最大生長速率比在常規MRS培養基中提高了1倍。乳桿菌能夠利用的碳源較多，除葡萄糖外，還有蔗糖、半乳糖、乳糖、果糖、甘露糖、水蘇糖、低聚果糖、低聚木糖等。由于乳桿菌基因的特異性及多樣性，不同的乳桿菌對培養基中碳源利用的偏好性不同，針對不同的乳桿菌可以添加或替換不同碳源以達到增強菌株活性的目的。如CARVALHO等[9]比較了葡萄糖、果糖、乳糖、甘露糖4種糖分別作為碳源時保加利亞乳桿菌的生理活性和抗凍性能，結果表明以甘露糖為碳源的培養基培養出的菌株生長量最大，同時菌株具有最好的抗凍效果。以蔗糖代替葡萄糖為碳源得到優化培養基用以培養植物乳桿菌LIP-1，凍干存活率也會有很大提升[10]。除了對常規培養基進行碳源的添加或替換，在培養基中添加一些生長因子也能提高乳桿菌的生理活性，使乳桿菌更好地適應凍干過程中的不利環境，這些生長因子包括無機鹽、氨基酸、天然產物等。如在MRS培養基中添加了0.5 mmol/L的Ca2+，不但使植物乳桿菌LIP-1的凍干存活率從55.15%提高到76.67%，并且常溫儲存8周后，比未添加組活菌數提高了13.65倍[10]。在常規培養基中額外添加氨基酸能夠提高保加利亞乳桿菌L2的抗冷凍干燥能力，添加了L-半胱氨酸的培養基得到了活性更高的菌株[11]。同樣在MRS液體培養基中添加了10%的番茄汁作為嗜酸乳桿菌的生長因子，也增強了菌株活性，提高了菌株的抗凍能力。此外，一些天然分子添加到培養基中也會增強菌株的抗凍能力。CHEN等[12]將NaCl、甜菜堿、谷氨酸鈉、山梨醇、甘露醇、甘露糖6種天然分子分別添加到MRS培養基中，研究添加天然分子對德氏乳桿菌生長活性及凍干存活率的影響，發現NaCl、山梨醇對菌株的凍干存活率有顯著影響，當二者的濃度分別為0.6%、0.15%時，保加利亞乳桿菌的凍干存活率最高，分別為42.7%和45.4%。以上研究可以看出，針對不同的乳桿菌開發出對應的優化培養基能夠得到活性更強的菌株，進而能提高菌株應對冷凍干燥不利條件的能力。

1.2 優化培養基促進乳桿菌生物膜的形成

生物膜可以維持細胞之間的化學物質交換，調節細胞運動和代謝產物的生產，并具有一定的機械穩定性，因此通過培養基優化促進乳桿菌形成更多生物膜有利于增強菌株抵抗不利環境的能力，提高菌株的冷凍干燥存活率。研究表明，若培養基中無碳源，則乳桿菌很難形成生物膜，當培養基中碳源濃度過高，也會抑制生物膜的形成[13]。因此，針對不同乳桿菌選擇合適的碳源濃度能促進生物膜的形成。另外一些金屬離子對生物膜的形成也有影響，Mn2+、Fe3+、Mg2+和Na+等金屬離子能促進生物膜形成，這是由于部分金屬離子能直接促進相關基因的表達，有學者將生物膜測定與轉錄組實驗相結合，發現培養基中K+顯著促進植物乳桿菌LIP-1中的luxs/ai-2群體感應系統中luxs基因的表達，促進了AI-2信號分子的合成，上調了生物膜形成的關鍵基因cysE基因的表達，從而促進了生物膜的形成，增強菌株的抗凍性能[14]。若加入D-半乳糖抑制劑則會抑制luxS和cysE基因的表達，減少生物膜的形成，降低凍干性能。而Cu2+、Al3+、Pb+和Zn+等金屬離子對生物膜的生長產生抑制作用，不利于菌株抵抗外界環境[15-16]，導致乳桿菌存活率降低，因此在培養基中選擇性地添加一些金屬離子能夠促進生物膜的形成，增強菌株的抗凍能力，進而提高凍干存活率。

1.3 優化培養基改變細胞膜不飽和脂肪酸比例

在冷凍干燥過程中，細胞內外形成的冰晶會刺破細胞膜，影響細胞膜的完整性；細胞由于脫水導致流動性降低，代謝功能受到影響，降低了冷凍干燥存活率。脂肪酸是影響細胞膜流動性的關鍵因素，不飽和脂肪酸的含量決定了細胞膜的黏度和厚度，不飽和脂肪酸所占比例越高，細胞膜的流動性越好，細胞抵抗冷凍能力就越強。因此研究人員通過優化培養基組分等方式提高細胞膜不飽和脂肪酸比例。通過調節pH、添加適宜濃度的油酸、無機鹽離子、吐溫80等能夠提高不飽和脂肪酸的比例。若將MRS培養基初始pH從7.4下調至6.8，則植物乳桿菌LIP-1的凍干存活率由72.43%增加至81.76%[17]。研究發現pH為6.8的培養基能更好地提高細胞膜不飽和脂肪酸的含量、更好地保持代謝關鍵酶活性、更好地維持細胞膜的完整性，減少菌株的凍干損傷，從而提升菌株的抗冷凍干燥性能。錢志浩等[18]通過氣相質譜聯用檢測發現在培養基中添加2 mL/L的吐溫80能顯著提高細胞膜不飽和脂肪酸比例，使鼠李糖乳桿菌FJND和短乳桿菌173-1-2的凍干存活率有了顯著提升。在培養基中添加適宜濃度的K+能促進基因簇中trkA基因和lysR型轉錄因子的上調，而lysR的上調促進了acc和fab家族基因上調。acc和fab基因的上調增加了植物乳桿菌LIP-1細胞膜不飽和脂肪酸C18:ln9c、C18:2n6c、C20:3n6和C20:4n6的含量，提高了細胞膜流動性，增強了植物乳桿菌LIP-1抗凍干性[19]。在培養基中添加0.001%的油酸同樣能夠提高細胞膜不飽和脂肪酸比例，提高植物乳桿菌冷凍干燥后的存活率，并且不同的乳桿菌具有不同的最佳油酸濃度[20]。

總之，通過優化培養基組成能夠增強菌株的代謝能力，提高菌株生理活性，促進菌株生物膜的形成增強自我保護能力，提高細胞膜不飽和脂肪酸含量增強細胞膜流動性并保護關鍵酶活性，進而提高乳桿菌的冷凍干燥存活率。

2 脅迫預處理增強乳桿菌抗凍能力

脅迫預處理是指在凍干前將菌液轉移至特定環境中一段時間，使菌株在該環境影響下增強抗凍能力，進而提高菌株的凍干存活率。具體的脅迫預處理方式包括冷脅迫[21]、熱脅迫[22]、酸脅迫[23]等。

2.1 冷脅迫預處理增強乳桿菌抗凍能力

冷脅迫預處理是將菌株放置于低于其最適生長溫度的環境一定時間，以增強其抗凍能力。冷脅迫對菌株抗凍能力的提升體現在維持細胞膜流動性、刺激冷應激蛋白的表達2個方面。研究表明冷凍環境下細胞膜的流動性會受到影響，冷脅迫能改變乳桿菌細胞膜脂肪酸的組成，提高其抗凍能力。不飽和脂肪酸所占比例越高，細胞膜流動性越好，抗凍能力也相應越強。王曉萌等[24]采用冷脅迫方法對嗜酸乳桿菌 ATCC 4356進行處理，8 ℃冷脅迫處理15 h，冷凍干燥后的存活率提升至96.64%，比未冷脅迫組提高了17.65%。乳桿菌為適應寒冷環境會上調冷應激蛋白的表達。冷應激蛋白(cold shock proteins，CSPs)是在冷刺激條件下產生的一系列抗凍蛋白質，分子質量約為7 ku，能使菌株更好地適應低溫環境和增強抗凍能力。李夢洋等[25]利用實時熒光定量PCR技術研究了冷脅迫處理對保加利亞乳桿菌LM1冷應激蛋白表達的影響，冷脅迫條件為20 ℃環境中靜置2 h，該處理能使菌株的cspA基因的mRNA拷貝數增加3.34倍左右，由此可以推測CSPs的表達量有所增加。EROGLU等[26]發現微生物菌體內的CSPs在低溫條件下，其蛋白質的空間結構穩定，保持了與底物的結合能力，仍具有較高的催化活性，提高了細胞的抗凍干能力，同時CSPs能保護細胞膜上相關酶，防止因酶變性而損害細胞[27]。以上研究均表明在乳桿菌冷凍干燥前進行冷脅迫預處理能夠增強其凍干存活率，并且不同的乳桿菌最適預冷凍溫度有差異。

2.2 熱脅迫預處理增強乳桿菌抗凍能力

熱脅迫預處理是指將乳桿菌放置在高于其最適生長溫度的環境中一定時間。經過熱脅迫與處理的乳桿菌抵抗不利環境能力增強，對冷凍干燥不利條件的抵抗能力也有一定的增強。研究顯示，熱脅迫處理使細菌細胞在冷凍干燥后能夠更快地恢復生長和產酸[28]。另外熱脅迫能促進熱休克蛋白的表達，這是細胞為適應不利熱環境選擇性上調表達的一類蛋白(Hsps)，包括伴侶蛋白(DnaK和GroEL)和輔因子(GOES)。熱休克蛋白能夠促進正確的蛋白質折疊，并幫助恢復變性蛋白質和新生多肽的結構-功能，保持菌株的代謝功能更為穩定[29]。ZHEN等[30]以45 ℃條件熱休克處理嗜酸乳桿菌 ATCC 4356 30 min，其凍干成活率由39.1%提高到56.3%。除了凍干存活率有所提升，菌株的糖代謝和能量代謝能力也有一定程度的增強。熱脅迫處理后，菌株的胞內葡萄糖轉化率提高了24.04%，胞外多糖的產量增加，半乳糖的產量從17%增加到26%，Na+-K+-ATPase活性顯著升高，這些變化共同提高了細菌細胞在凍干環境中的活力和存活率。嗜酸乳桿菌通過熱脅迫處理也能提高凍干存活率，當脅迫處理條件為46 ℃溫度下熱脅迫處理30 min，凍干存活率為56.77%，比對照組存活率提高了50.66%[31]。以45 ℃熱脅迫處理嗜酸乳桿菌ATCC 4356 30 min并結合凍干保護劑，菌株的存活率達到92.8%[32]。總之，熱脅迫預處理對菌株的積極作用體現在促進熱休克蛋白表達、維持細胞的正常能量代謝，維持細胞在不利環境中的活力，進而增強其抗凍能力，提高冷凍干燥存活率。

2.3 酸脅迫預處理增強乳桿菌抗凍能力

酸脅迫預處理是指將菌株放置于低于其最適生長pH的環境一定時間，以增強其抗凍能力。不同的乳桿菌有不同的最適酸脅迫條件。低pH環境對菌株抗凍能力的增強主要是通過調節其代謝途徑使菌株更加適應冷凍條件。酸脅迫對菌株代謝途徑影響最大的是糖酵解途徑和脂肪酸代謝途徑。研究人員通過轉錄組學和蛋白質組學技術研究發現，一方面酸脅迫促進了糖酵解途徑中丙酮酸向乳酸的轉化，在酸脅迫下，乳酸脫氫酶基因表達上調，加速了糖酵解，為菌株生長提供了更多的能量，菌株可以利用這些能量來提高對惡劣環境的適應能力[33]。另一方面，酸脅迫促進了ACC家族基因、Fab家族基因和丙酮酸脫氫酶基因表達上調，ACC家族基因和Fab家族基因的表達促進了脂肪酸碳鏈的延伸，增加了碳鏈上的不飽和雙鍵，提高了不飽和脂肪酸的相對含量，而丙酮酸脫氫酶基因表達上調能促使丙酮酸轉化為乙酰輔酶A，進而影響了細胞膜脂肪酸的代謝和合成[34]。由此可見，經過酸脅迫預處理乳桿菌細胞膜不飽和脂肪酸的比例更高，使菌株細胞膜有更好的流動性，細胞膜完整性更高，因此具有更高的凍干存活率。

目前除了單一條件的脅迫預處理，也有將多種脅迫預處理方式交互使用的研究，并且取得了良好的效果。如楊婕等[35]研究發現酸-冷交互脅迫對發酵乳桿菌ATM的凍干存活率有很大提升，存活率達到87.19%。交互脅迫預處理對于不同的脅迫條件有更為嚴格的要求，因此需要更加深入的研究。

3 添加凍干保護劑降低乳桿菌冷凍干燥損傷

3.1 凍干保護劑分類

冷凍干燥技術被認為是最為溫和的脫水技術，廣泛應用于各類益生菌菌粉的制備。但在凍干過程中，由于低溫、干燥、高滲等多重不利因素影響，菌體細胞膜易受到環境中及胞內水分子形成的不規則冰晶的破壞，代謝能力下降導致菌株受到不可逆的損傷，因此需要在冷凍干燥之前加入保護劑以保持凍干過程中菌株的穩定性，提高菌株的存活率，維持細胞內部關鍵酶活性。保護劑的種類很多，按照滲透性可以分為滲透類、半滲透類和不滲透類保護劑。如圖2所示，滲透類保護劑指保護劑能夠透過細菌的細胞壁和細胞膜，調節胞內胞外滲透壓平衡。甘油是經典的滲透類保護劑，能夠增強細胞膜的流動性，抑制細胞過度脫水，冰與水結合，抑制冰晶的形成，從而達到保護菌株的效果。半滲透類保護劑指保護劑能透過細胞壁但無法透過細胞膜，一般包括小分子糖如海藻糖[36]、甘露糖[37]、棉籽糖[38]、蔗糖[39]等，小分子糖含有的游離羥基能夠與蛋白質極性基團和細胞膜上磷脂結合形成氫鍵，為細胞提供機械保護。另外這類保護劑能夠誘導細菌質壁分離，集中在細胞膜和細胞壁之間阻止冰晶的生長。不滲透類保護劑指保護劑不能進入細胞壁及細胞膜，在細胞的外側為細菌提供保護，包括乳清蛋白[40]、脫脂乳[41]等大分子。這類保護劑可以吸附在細菌壁外表面形成保護殼[42]，為菌株提供一個相對封閉的環境，阻止細胞與冰晶的接觸并能減少與氧氣的接觸，從而減少菌株損傷。

圖2 凍干保護劑的分類Fig.2 Classification of lyophilized protective agents

3.2 凍干保護劑對乳桿菌的保護

由于不同類型保護劑的保護機制不同，單一類型的凍干保護劑往往不能達到很好的保護效果，因此研究人員通常將多種類型的保護劑進行復配從而得到復合凍干保護劑，從多個方面對菌株進行保護。復合凍干保護劑的開發一般通過正交試驗或響應面法，將不同類型的保護劑進行組合，以菌株的凍干存活率為響應值，通過實驗數據預測出最佳復合凍干保護劑配方并加以驗證，最終得到保護效果最好的凍干保護劑。表1總結了近年來針對不同的乳桿菌開發的凍干保護劑。由表1可以看出，凍干保護劑的種類較多，添加了復合凍干保護劑的乳桿菌凍干存活率都在80%以上。

4 優化預冷凍條件降低乳桿菌冷凍干燥損傷

4.1 預冷凍溫度對乳桿菌冷凍干燥存活率的影響

合適的預冷凍溫度是冷凍干燥技術的重要一環，若預冷凍溫度不足夠低，則樣品將無法完全冷凍，真空升華過程中融化并且膨脹發泡，影響最終的菌粉狀態。若預冷凍溫度過低，不僅會增加能耗浪費資源，而且會加重菌體損傷，降低菌株的凍干存活率，因此預冷凍溫度對菌株的凍干存活率有重要影響。如表1所示針對不同的菌株和保護劑，研究人員采用不同的預冷凍溫度最大程度降低對菌株的損傷。不同屬的乳桿菌有不同的最適預冷凍溫度，如鼠李糖乳桿菌Lr-1的最適預冷凍溫度為-20 ℃，植物乳桿菌SC1的最適預冷凍溫度為-70 ℃。同屬的乳桿菌在不同條件時最適預冷凍溫度也有所差異。WANG等[52]的研究表明，當使用山梨醇為保護劑時，植物乳桿菌AR113、AR307和WCFS1的最佳預冷凍溫度分別為-196、-40和-20 ℃，當使用海藻糖為保護劑時，植物乳桿菌AR113、AR307和WCFS1的最佳預冷凍溫度分別為-20、-60和-60 ℃，可見最佳預冷凍溫度的選擇與保護劑種類和菌株的特異性有關。

表1 不同乳桿菌對應的凍干保護劑Table 1 Lyophilized protective agents corresponding to different Lactobacillus

4.2 降溫速率對乳桿菌冷凍干燥率的影響

降溫速率是影響菌株在預冷凍過程中保持活性的關鍵因素。如圖3所示，在預冷凍階段，合理控制降溫速率能夠減少細胞冷凍損傷[53]，A表示降溫速率過慢，細胞會由于過度脫水而收縮，細胞內部溶質集中，過度濃縮，可能導致蛋白質失活，進而引起細胞死亡；C表示降溫速率過快，胞外環境以及胞內水分子容易形成大量細小的無規則冰晶，容易刺破細胞對菌體造成嚴重損傷；B表示最佳降溫速率，在最佳降溫速率條件下不會出現溶質效應和胞內結冰，降溫速率與細胞內部水分的滲透率相適應，能最大程度降低細胞損傷。不同乳桿菌的最佳降溫速率不同，植物乳桿菌ST-3在降溫速率為-1 ℃/min條件下得到最高凍干存活率，干酪乳桿菌LC2 W在-10 ℃/min條件下凍干存活率最高[54]。目前針對乳桿菌冷凍干燥過程中降溫速率對存活率的影響研究有限，因此設計合理的降溫速率進行梯度降溫還有很大的研究空間。

圖3 不同降溫速率對細菌存活的影響(修改自RAJU等[53])Fig.3 Effects of different cooling rates on bacterial survival

5 展望

近年來，對于如何將乳桿菌更好地應用于產品開發成為食品學領域的熱點。生產出具有高活菌數并且能夠很好耐受胃液、腸液、膽鹽環境等不利條件的乳桿菌菌粉是研究人員的目標。目前針對增強乳桿菌抗凍性能，提高乳桿菌冷凍干燥存活率的研究仍在不斷探索當中，針對特定的菌株確定特定的培養及優化、脅迫預處理、凍干保護劑和預冷凍條件的研究較多，但對不同乳桿菌具有普適性保護效果的凍干保護劑及保護條件研究較少。對于既能起到凍干保護作用，又能促進菌株生長發育的新型益生元類凍干保護劑也在不斷開發當中，這對提高乳桿菌冷凍干燥存活率及后續乳桿菌在腸道中的生長定植有著重要意義，同時也對人類健康發展有著重要的意義。