醬香白酒釀造輪次醇甜典型體基酒風味解析

熊小月，李利利，馬宇，黃永光*，尤小龍，程平言

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025)2(六盤水師范學院，貴州 六盤水，553004)3(貴州茅臺酒廠(集團)習酒有限責任公司，貴州 習水，564622)

醬香型白酒作為我國傳統四大香型白酒之一，經獨特的“2次投糧、9次蒸煮、8次發酵、7次取酒”釀酒工藝，其風味較為獨特。早在1965年，行業內就通過感官品鑒將醬香白酒基酒分為“醬香、醇甜、窖底香”3種典型體[1]。具有似醬油風味特征的酒稱為“醬香”典型體基酒，多產生于窖面糟發酵酒醅；由窖池最底部靠近窖底酒醅蒸餾而得，己酸乙酯風味較重的基酒稱為“窖底香”典型體基酒；由窖池中部發酵酒醅蒸餾而得的基酒，酒體醇甜協調，稱為“醇甜”典型體基酒[2]。醬香成品酒由3種典型體基酒酒樣勾調而成，目前對于3種典型體基酒的研究局限于感官評價，其風味化合物組成、特征風味組分及風味模塊結構差異鮮有報道。

酒體風味是評價白酒品質的重要指標，解析醬香白酒風味成分一直是酒類風味化學領域研究的熱點[3]。近年來，對醬香型白酒風味的研究較多[4]，NIU等[5]用氣相色譜-嗅覺法、香氣強度、嗅覺閾值和氣味活性值對茅臺酒中酯類物質進行全面解析，其中基于風味稀釋值和香氣活力值(odor activity value，OAV)的13種化合物被認為是重要的香氣化合物；ZHAO等[6]采用Sephadex LH-20柱層析和高效液相色譜法從醬香型白酒中分離純化了1種焦糊香氣化合物。但現有研究大多都集中于醬香白酒、成品酒的風味，對3種典型體的研究不足[7-8]：馬宇[7]系統解析傳統醬香型白酒的3種典型體基酒風味化合物，發現醇甜基酒中OAV>1的物質有25種，對醬香型白酒整體香氣有重要貢獻作用；李利利等[8]利用液液萃取結合氣相色譜-質譜法(liquid liquid extraction combined with gas chromatography-mass spectrometry，LLE-GC-MS)及保留指數法，對釀造輪次醬香典型體進行了風味結構解析，并分析了其特征風味。針對醬香白酒醇甜典型體的風味結構特征的相關研究尚處于空白階段。

醬香型白酒醇甜典型體不僅有呈甜味的作用，還對醬香型白酒的香味香氣具有緩沖作用，對其整體風味的形成十分重要[1-2]。為充分認識醬香白酒風味化合物結構及其風味特征，進一步揭示各輪次醇甜典型體基酒間的差異性，本研究以貴州XJ公司醬香型白酒中輪次醇甜典型體基礎酒為對象，采用LLE-GC-MS結合OAV分析其主要揮發性風味化合物，研究醬香型白酒輪次醇甜典型體基酒的風味成分結構特征，以助推我國赤水河流域醬香白酒產業基地建設及發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貴州XJ公司2017—2018年度四車間生產過程中的輪次醇甜典型體酒基酒(盤勾后綜合酒樣)，1～7輪次醇甜酒樣各1 L。具體酒樣信息見表1。

表1 不同生產輪次醇甜典型體基酒樣品Table 1 Samples of alcohol-sweetness typical body base Baijiu in different production rounds

2-辛醇(色譜級)、C7～C40正構烷烴，美國Sigma-Aldrich公司；無水Na2SO4、無水乙醚、濃硫酸、NaCl、NaHCO3、乙酸乙酯、戊酸乙酯、2-丁醇、丙醇、異丁醇、2-甲基-1-丁醇、庚酸乙酯、1-戊醇、正丁醇、異戊醇、辛酸乙酯、正己醇、癸酸乙酯、正辛醇、2,3-丁二醇、丁二酸二乙酯、乙酸、丙酸、十四烷酸乙酯、苯酚、丁酸、十五烷酸乙酯、十六烷酸乙酯、苯甲醛、苯乙醇、油酸乙酯、糠醛、2-乙?；?5-甲基呋喃、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、己酸、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、苯丙酸乙酯、四甲基吡嗪、4-乙基苯酚、乙醛、3-羥基-2-丁酮，上海國藥集團；正己烷(色譜純)，德國Meker公司；實驗中所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

GC 7890-5975 MSD型GC-MS聯用儀、DB-FFAP毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Agilent公司；MPS2型多功能自動進樣系統，德國Gerstel公司；Aquaplore3S超純水系統，美國艾科浦公司；OA-SYS型氮吹儀，上海安譜科學儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 LLE-GC-MS分析醬香型白酒輪次醇甜典型體基酒風味成分

參照馬宇[7]的方法，用超純水將150 mL酒樣稀釋至乙醇體積分數為13%，加100 μL內標(2-辛醇)，加入NaCl飽和。用體積分數20%的鹽酸調節樣品pH至2，用60 mL乙醚分3次萃取，靜置分層后合并有機相得到酸性組分。水相用100 g/L NaOH溶液調節pH至12，用60 mL乙醚分3次萃取，靜置分層后合并有機相得堿性組分。余下水相調節pH至7，用60 mL乙醚分3次提取，合并萃取液得到中性組分。分別添加過量無水Na2SO4至3個組分中，并置于-20 ℃下過夜干燥，氮吹濃縮至1.5 mL，最終進樣量為1 μL，待下一步檢測分析。

GC條件：色譜柱初溫40 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升溫到100 ℃，再以4 ℃/min升溫至220 ℃，維持5 min。進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，載氣He(純度≥99.999%)，流速2.0 mL/min。

MS條件：電離方式EI，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；掃描范圍m/z35～350。

1.3.2 定性定量分析

利用NIST11a.L譜庫檢索并結合保留指數(retention index，RI)對未知化合物定性，其中RI的計算方法參照改進后的Kovats方法[9]計算。

本研究中有標樣的化合物用外標法定量，無標樣的化合物采用內標法定量。標準曲線法定量：以體積分數為13%的乙醇溶液為溶劑配制待測物標準液，并進行梯度稀釋，分析條件與酒樣分析條件相同。采用選擇離子法計算各化合物的峰面積，以化合物與內標物的峰面積比為橫坐標，質量濃度之比為縱坐標，建立相關物質標準曲線，進行全定量分析。內標法定量：通過計算內標物(2-辛醇)的峰面積和樣品中各組分的峰面積比值，從而定量出各個風味成分的含量，進行半定量分析。

1.3.3 感官分析

參考孫優蘭等[10]的方法，酒體風味感官品評小組由11人組成(5名男性和6名女性)，均通過良好的白酒品評專業培訓，其中1名國家級評委、3名省級評委。先對樣品進行多次重復品評，描述出盡可能多的感官香氣屬性，再經重復篩定，最終確定感官屬性為似醬油香、焦糖香、水果香、花香、醇香、甜香、糟香和焦糊香。根據感官定量描述分析方法構建系列酒風味輪廓分析圖，單項屬性評定分值設定范圍為0～5分，其中0分代表沒有香氣強度，5分代表香氣極強。

1.4 數據統計與分析

香氣活力分析參考文獻[11]的方法計算OAV。

采用Excel 2010對數據進行計算，使用Cytoscape繪制關系網絡圖，使用R語言繪制熱圖，Simca14.0繪制偏最小二乘回歸(partial least squares regression，PLSR)圖，Origin 2018繪制雷達圖和堆積柱狀圖。

2 結果與討論

2.1 各輪次醇甜典型體基酒風味化合物組成

采用前述LLE方法，對釀造不同輪次醇甜典型體基酒樣品進行前處理，分酸性、堿性、中性3個組分，分離后進樣分析。從7個輪次醇甜典型體基酒中共檢出主要揮發性風味化合物185種，其中芳香族26種、酯類50種、醇類51種、呋喃類9種、吡嗪類11種、酸類22種、醛及縮醛4種和酮類12種。對各輪次檢出的主要揮發性化合物種類及含量進行對比分析，如圖1所示。

圖1 醇甜典型體基酒風味化合物含量及風味化合物種類變化趨勢Fig.1 Flavor compound content and variation trend of flavor compounds in alcohol-sweetness typical body base Baijiu

各輪次醇甜典型體基酒中，酯類、醇類、酸類占各酒樣檢出風味化合物總含量的65%以上，在酒樣風味組成中占主導地位，與王曉欣[12]對醬香、濃香型白酒的研究結論基本一致。從檢出結果看，主要酯類物質在1～7輪次間具有相同變化趨勢，其在1～7輪次酒樣的總含量依次為1 103.14(J1)、1 174.14(J2)、1 036.75(J3)、842.88(J4)、1 483.44(J5)、1 239.29(J6)、790.06(J7) mg/L，其中5、6輪次的含量較高，其他輪次間無顯著差異。醇類化合物在1～7輪次的總含量分別為415.16(J1)、548.56(J2)、381.68(J3)、729.85(J4)、1469.70(J5)、1027.29(J6)和245.30(J7) mg/L，其在4、5、6輪次樣品中含量最高，而在7輪次的含量最低。酸類化合物在1～7輪次的含量分別為495.97(J1)、441.19(J2)、368.02(J3)、546.14(J4)、966.76(J5)、1 682.27(J6)和457.18(J7) mg/L，其中除3輪次外，在輪次間呈現逐漸增加趨勢；在6輪次含量驟增，這主要源于乙酸、異丁酸、丁酸在6輪次含量較高所致，在7輪次含量降低，與1、2輪次相近。

除此之外，芳香族化合物相對于其他微量成分的含量也較高，在6輪次中的含量最高(872.47 mg/L)，1～5輪次的含量均在150～320 mg/L，7輪次的含量最低(17.37 mg/L)。整體來看，輪次醇甜典型體基酒風味化合物組成差異較大，但種類和含量總體均是先上升后下降、再上升、再下降的變化趨勢，這與醬香典型體輪次基酒中種類與含量的變化趨勢一致[13]。同時，對比楊大金等[14]和馬宇[7]的研究結果發現，輪次綜合樣基酒風味物質的種類與含量主要是在2、4、5輪次較高，而醇甜典型體主要是在5、6輪次含量較高，體現出了醇甜典型體基酒的特點。

2.2 各輪次醇甜典型體基酒主要揮發性化合物

為更好研究各類主要風味化合物含量的變化特征，對各組分化合物中含量與閾值較高的物質按其含量變化做熱圖(共102種)，其中酯類31種，醇類22種，酸類13種，芳香族14種，呋喃吡嗪12種，酮類10種(圖2)。

圖2 輪次醇甜典型體基酒風味化合物熱圖Fig.2 Heatmap of the flavoring compounds of the alcohol-sweetness typical body base Baijiu in different rounds

酯類物質是白酒中重要的呈香物質，是構成酒體的香味成分和特殊風味的主要基礎物質[15]。結合圖2中的酯類，發現在7個輪次中均檢出的酯類物質有12種，包括亞油酸乙酯(40～350 mg/L)、乙酸乙酯(1～25 mg/L)、乳酸乙酯(50～300 mg/L)，丁二酸二乙酯(1～100 mg/L)、十六酸乙酯(80～360 mg/L)、油酸乙酯(100～420 mg/L)等。在這12種酯類化合物中有9種是高級脂肪酸乙酯，這些酯類(亞油酸乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯、硬酯酸乙酯等)與NIU等[5]對醬香白酒成品酒中的酯類化合物研究結論有較大差異，即在成品酒中同一類高級脂肪酸乙酯的含量(10～50 mg/L)遠低于醇甜典型體基酒，這可能是成品酒勾調時選取了高級脂肪酸乙酯含量很低的組合基酒，形成了低含量高級脂肪酸乙酯的產品酒。同時，這些酯類物質在3～6輪次中含量較高，這與馬宇[7]對傳統醬香白酒醇甜基酒中酯類化合物的變化趨勢研究結論一致，在3輪次之后，隨著淀粉利用率提高，微生物生長越來越豐富，風味化合物含量也隨之升高。孫優蘭等[10]對清醬香型白酒風味特征的研究中也發現，系列酒中醬香風味越明顯的樣品其高級脂肪酸乙酯含量越高。白酒中高級脂肪酸乙酯具有呈香、呈味作用，可延長白酒的后味，增添酒體的豐滿感[15]。所以，高級脂肪酸乙酯含量的變化和差異性可能是影響成品酒、輪次酒與醇甜典型體風味結構差異的重要因素之一，其具體機制仍然需要進一步研究。

醇類是形成酒體爽口性的重要成分，適量的高級醇可增加酒體的甜度和醇厚感，特別是一些特征性醇類化合物。在7個輪次中均檢出的醇類物質有8種，除乙醇外，丙醇(14～170 mg/L)、異丁醇(10～90 mg/L)、正丁醇(15～200 mg/L)、異戊醇(2～230 mg/L)等醇類物質在醇甜典型體基酒中含量較高。結合圖2對比分析發現，正丙醇在1、6、7輪次含量較高，2～5輪次含量較低，這與楊大金等[14]對輪次基酒研究一致。1、6、7輪次微生物可利用糖分低，微生物通過氨基酸代謝生成正丙醇，正丙醇的含量增多，會導致酒體較苦澀，與醬香輪次醇甜典型體基酒感官品評結果一致。異丁醇與正丁醇在1、7輪次含量較低，而在其他幾個輪次含量較高，但輪次間的整體差異較小。正辛醇、正壬醇、2-糠醛縮二乙醇、正戊醇、2-庚醇等在3、4、5輪次中檢出含量較多。2,3-丁二醇在1、4輪次檢出，在4輪次檢出較高(15.97 mg/L)，研究表明2,3-丁二醇能促進一些與醬香有關物質的增加[16]，與4輪次醬香風味明顯可能有較大聯系，需進一步研究。同時，在白酒中醇類化合物含量越高，其香氣與醇甜感越好[17]。

酸類化合物是白酒中的重要風味物質，其在酒中有緩沖平衡、助香和呈味等作用，同時可催化酒體老熟，尤其是一些重要的酸類化合物可以使酒體趨于醇厚、綿柔，提升白酒的豐滿度和醇和度，消除白酒的糙辣感[18-19]。在1～7個輪次醇甜典型體基酒中均檢出乙酸、異丁酸、丁酸。其中，乙酸在1輪次的含量較高，2、3輪次開始降低，之后隨著輪次增加含量相應增多，在6輪次達到最大(518.66 mg/L)，這是由于發酵前期細菌大量繁殖代謝產酸，隨后細菌減少酸含量略有下降，發酵一定時間后細菌數量增加進一步產酸，從而乙酸增多[19]。異丁酸(40～210 mg/L)與丁酸(40～230 mg/L)在1～6輪次含量逐漸增加，在6輪次達到最高。除了上述3種酸類物質外，丙酸以及棕櫚酸均在6輪次中含量較高。己酸在1輪次未檢出，在2～6輪次含量(16～170 mg/L)不斷增加，在7輪次降低為15 mg/L。2-甲基己酸只在4輪次醇甜典型體中檢出，且含量較高(196.54 mg/L)。由此看出，酸類物質主要是在4、5、6輪次含量高，這與各輪次間醇甜典型體基酒口感風味差異關聯度較大，可對每個輪次風味進行感官描述分析，再結合實際數據，具體分析各酸類物質對酒體的主要貢獻。

芳香族化合物具有香氣突出、香味強度大、香氣保留時間長等特點，賦予酒體優雅、醇厚的風味、風格[20]。在1～7個輪次醇甜典型體基酒中均檢出5種，其中有呈濃烈香甜的蜂蜜香氣的苯乙酸乙酯(119.68 mg/L)與呈花香、水果香的乙酸苯乙酯(92.79 mg/L)均是在6輪次中含量最高，在其他幾個輪次的含量差異較小；呈玫瑰香、水果香、蜜香的苯乙醇在7個輪次醇甜典型體基酒中整體含量較高，在1～6輪次中不斷增加，在6輪次達到最高(330.27 mg/L)。而呈煙熏味的酚類物質，主要以2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚含量較高，其在6輪次含量最高(65.85 mg/L)，其他幾個輪次差異較??；其他酚類物質只在1、2輪次中檢出，這與實際生產中1、2輪次帶少許煙熏味、苦味風味相吻合，這類物質的出現可能與醬香白酒生產丟糟、微生物結構密切相關。在對芳香族化合物分析過程發現，除酚類物質主要是在1、2輪次中檢出外，其他呈香物質在各輪次間都均有不同分布，且大多數都是在6輪次含量最高，這與6輪次醇甜典型體基酒的風味強度較大有關。

呋喃、吡嗪類化合物大多呈烘培香、焦香且是醬香白酒中的重要風味。早在1981年，有研究者提出呋喃、吡嗪類化合物和可能與醬香型風味有關[21]，后證實吡嗪并不能直接貢獻醬香香氣，但吡嗪類化合物仍然是醬香型白酒的重要特征成分[22]。從1～7輪次醇甜典型體中共檢出呋喃9種、吡嗪11種，在每個輪次中的總含量相對上述4類物質較低。呋喃類的含量在35～230 mg/L，2、5輪次含量最高(約200 mg/L)，3、4、6輪次含量也較高(>100 mg/L)。在2～5輪次中糠醛含量在110～200 mg/L，占呋喃類總含量的80%以上，是醬香白酒中的重要呈焦香類物質。而呈烘培香、烤玉米香、堅果香的大多是吡嗪類物質，其在7個輪次醇甜典型體基酒整體含量較低。同時，在7個輪次醇甜典型體中均檢出4種吡嗪物質：2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪，其在1～6輪次中隨著生產原料利用率提高，含量逐漸增加，在6輪次含量達到最高，而在7輪次稍降低；并且這4種吡嗪類物質與醬香白酒中5～7輪次的烘培香、焦香有直接聯系。以四甲基吡嗪為代表的含氮類化合物被認為是醬香型白酒的特征性風味成分[23]，本研究中四甲基吡嗪只在1、2、6輪次醇甜典型體基酒中檢出，6輪次含量較高(8.21 mg/L)，與韓興林等[24]對傳統方式釀造的醬香輪次基酒的研究結論有所差異，這可能是由于測定樣品不同所致。

其他類化合物主要包括醛酮類化合物，如5-甲基呋喃醛在7個輪次醇甜典型中均有檢出，在3～7輪次含量較高，在1、2輪次含量較低；呈黃油味、酸奶味的3-羥基-2-丁酮在7個輪次醇甜典型體基酒中均有檢出，在2、3輪次含量較高，5、6輪次含量約為2.5 mg/L，稍低于前兩輪次，與輪次基酒中的變化趨勢較為相似[13]，其存在于乳品和水果中，具有令人愉快的香氣[24]。

2.3 釀造醇甜典型體基酒各輪次特征化合物及其輪次間的差異

為了進一步探索1～7各輪次醬香白酒醇甜典型體基酒的特征化合物，對重要風味化合物進行全定量分析，并對這些化合物進行OAV計算、統計分析，將所得OAV>1的化合物與其輪次作關系網絡圖與同類呈香化合物OAV進行均值化處理作風味雷達圖，同時采用PLSR法建立模型探索輪次醇甜典型體基酒的感官屬性與其特征香氣化合物之間的關聯，結果如圖3所示。

a-OAV關系網絡圖(淺黃色節點代表輪次，外部節點代表香氣化合物，不同的顏色代表不同香氣化合物的類別，節點大小與關聯香氣化合物的數量有關)； b-感官屬性與重要香氣化合物PLSR圖； c-風味物質OAV雷達圖； d-感官屬性風味雷達圖圖3 輪次醇甜典型體基酒感官屬性及特征揮發性風味化合物解析Fig.3 Analysis of sensory attributes and characteristic volatile flavor compounds of the alcohol-sweetness typical body base Baijiu in different rounds

匯總分析結果表明，在釀造輪次醇甜典型體基酒中OAV>1的主要揮發性風味化合物有40種，其中醇類8種、酸類6種、酯類13種、呋喃吡嗪5種、芳香族6種以及醛酮各1種，其在酒體中的定性定量結果詳見電子版增強出版附表。從圖3-a可知，7個輪次中，3、4、5輪次醇甜基酒的貢獻性風味化合物較相似，6輪次中貢獻風味的化合物略多于1～5輪次，1輪次基酒中貢獻風味的化合物多于2、3輪次，這主要源于醬香白酒釀造的下造沙工藝及其釀造原料的利用差異化所致。進一步分析各輪次主要揮發性化合物的呈香貢獻特征，將其分為6個模塊，并根據各輪次呈現不同風味模塊OAV大小作風味雷達圖分析。由圖3-c可知，似醬香(烘培香、堅果香、奶酪香)、焦糖香等特征香在醇甜典型體各輪次基酒中均有體現，1、2輪次香氣變化一致，且花香風味較為突出；3～5輪次變化一致，似醬香與水果香OAV高于其他香氣，酒體醬香、果香及其復合香優雅；而6輪次中似醬香風味OAV均低于3～5輪次，焦糖香、甜香OAV較高；7輪次中各香氣OAV均較低。

在此基礎上，采用PLSR方法建立模型，其中X代表白酒的香氣化合物變量；Y代表感官變量和樣本，其相關分析載荷圖結果見圖3-b。輪次醇甜典型體基酒風味存在明顯差異，從感官分析，沿PC2軸以似醬油香、水果香、花香、甜香、焦糖香為主，均分布在載荷圖上方；而糟香、焦糊香分布在下方。其中，J1、J2、J7分布在三象限與糟香有良好的相關性，而J3、J4、J5分布在一二象限與似醬油香、水果香、花香具有良好相關性。J6主要分布在第四象限與焦糊香、焦糖香、甜香、似醬油香氣有良好相關性。圖3-d感官品評結果發現，兩者有較好的關聯性。在醇甜典型體基酒中，1～7輪次均有醇香，1、2輪次糟香較突出，3、4、5輪次似醬油香、花香、水果香較好，6輪次中除了有較好的似醬香、花香、水果香外，焦糊香與焦糖香均較突出，7輪次中，除焦糊香較突出外，各香氣均減弱。

3 結論

本研究以醬香型白酒釀造1～7輪次的醇甜典型體基酒為研究對象，應用LLE-GC-MS對1～7輪次醇甜典型體基酒進行定性定量分析，同時對檢出主要揮發性化合物進行OAV計算、分析，總結出各個輪次醇甜典型體的風味特征。結合OAV篩選與感官品評，醇甜典型體酒的風格特征是以醬香為主，醇香、水果香、花香為輔的復雜香氣的酒體，其中3、4、5輪次醇甜典型體基酒中以醬香、水果香、花香為主；6輪次除似醬油香、水果香等突出外，焦糖香較好；1、2輪次中糟香較為突出；7輪次中除焦糊香突出外，糟香味也較重。對1～7個輪次醇甜典型體基酒風味具有主要貢獻的成分有9種，具體為十四酸乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯、糠醇、糠醛、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、3-羥基-2-丁酮；對3、4、5輪次具有風味貢獻的化合物除上述9種外，還有戊酸乙酯、乙酸戊酯、辛酸乙酯、2,3-丁二醇、正壬醇、丁酸、異戊酸、苯乙酸乙酯、正己酸乙酯和3-苯丙酸乙酯；除此之外，6輪次還有苯乙醛、苯乙酸乙酯貢獻也較大；1、2輪次除基本香氣化合物外，較為突出的成分有：3-苯丙酸乙酯、苯乙酸乙酯；7輪次主要以前述9種主要貢獻性成分為主，其中呈焦糊香的吡嗪類在7輪次中OAV較大，香氣貢獻較高。