狹果茶藨子營養成分分析與氨基酸提取工藝優化及評價

劉哲，葉英*，羅黎霞，王虹，張祎睿

1(青海大學 農牧學院，青海 西寧，810016)2(青海大學 化工學院，青海 西寧，810016)

狹果茶藨子(RibesstenocarpumMaxim)，又名長果醋栗，為虎耳草科茶藨子屬，該屬植物在世界約有160余種[1]，目前，我國在不同地方開展了茶藨屬植物資源的調查[2]，其中以陜西、四川、新疆、青海等地分布較多[3]，大多生長在山坡灌叢、山地針葉林或溪旁。據相關資料記載，茶藨子的各個部位都具有一定的價值[4]，其果實漿汁飽滿，富含營養成分，如維生素、粗纖維、蛋白質、黃酮類及氨基酸等[5]，具有降三高、保護心血管等生理功能[6]。茶藨子不僅風味獨特、天然無污染，而且具有良好的加工性能，可用于功能性食品的開發，故又被稱作第3代水果[7]。青藏高原茶藨子資源分布廣泛，但大多處于野生狀態，目前對其化學成分的研究尚處于起步階段，且多集中于有機酸、黃酮、花青素以及生物堿等活性成分，關于氨基酸的研究鮮有報道。

氨基酸作為植物蛋白組成的基本物質單元，不僅影響著食品的風味與營養價值，同時能夠提高人體免疫機制[8]。SADZUKA 等[9]通過藥理試驗發現，茶氨酸可以通過增加阿霉素的濃度，抑制腫瘤活性。HASE等[10]發現，酪氨酸能夠明顯改善思維記憶能力以及可能由身體或精神上的超負荷引起的情緒惡化，通過增加酪氨酸的攝入量來達到對心理及行為的有益影響。研究發現，茶藨子果實是良好的天然氨基酸植物源，能補充人體必需的氨基酸，因此有必要進一步研究其提取工藝及成分組成。近年來，有關天然產物氨基酸的提取方法較多，主要有加熱回流法[11]、超聲波法[12]、微波法[13]、超臨界流體萃取法[14]等。其中超聲波法是最常用的一種提取方法，依據超聲過程中釋放的機械作用破壞植物細胞壁和細胞膜，從而提高從天然產物中提取生物活性化合物的效率，該方法用時短、無需高溫處理便能使活性成分高效率的溶出，從而達到系統性評價其成分組成的目的。

為了全面深入地探究青藏高原特色漿果資源狹果茶藨子的綜合品質及食用價值，本試驗對狹果茶藨子果實中粗脂肪、粗蛋白、粗纖維、礦質元素及總糖含量進行測定，采用超聲波輔助提取法結合響應面試驗優化氨基酸提取工藝參數，并利用氨基酸分析儀對其成分組成進行分析，以期從營養學角度較系統地闡述狹果茶藨子的使用價值，同時也為該漿果資源功能性食品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

狹果茶藨子果實采自青?；ブ杉睾０? 029 m，經度101°50.926，緯度36°57.670。狹果茶藨子清洗后經實驗室高能球磨儀處理成漿，4 ℃冰箱冷藏，備用。

Cu、Zn、Fe、Mn、Ca、Na、Mg、P、K、Se、Cd、Pb、Cr、V、Ge元素的1 000 μg/mL的標準溶液，國家標準品試劑中心；無水乙醇、KH2PO4、Na2HPO4、水合茚三酮、谷氨酸標準品為化學純，天津化工有限公司。

1.2 儀器與設備

KQ-5200DB超聲波清洗機，江蘇昆山超聲儀器有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計，蘇州島津儀器有限公司；UBE-V0.2L實驗室高能球磨儀，長沙德科儀器有限公司；K9840凱氏定氮儀，海能儀器股份有限公司；L-8900型氨基酸自動分析儀，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 營養成分測定方法

參考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》中索氏抽提法測定粗脂肪含量；參考GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法測定粗蛋白含量；參照GB 5009.8—2016《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》中高效液相色譜法測定總糖含量；參考GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》中化學分析法測定粗纖維含量；按照GB 5009.268—2016《食品中多元素的測定》中電感耦合等離子體-原子發射光譜法(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES)和電感耦合等離子體-質譜法(inductively coupled plasma-MS，ICP-MS)測定各元素含量。

1.3.2 狹果茶藨子氨基酸提取單因素試驗

準確稱取數份10 g狹果茶藨子鮮果漿液，以氨基酸提取量為評價指標，研究超聲時間(10、20、30、40、50 min)、超聲溫度(25、35、45、55、65 ℃)、超聲功率(200、250、300、350、400 W)、乙醇體積分數(30%、40%、50%、60%、70%)、液料比[25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1(mL∶g)]及提取次數(1、2、3、4、5次)對狹果茶藨子果實中游離氨基酸提取效果的影響。每組試驗均平行測定3次。

1.3.3 Plackett-Burman(PB)試驗設計

Plackett-Burman 設計是一種成熟且廣泛使用的統計技術，通過忽略變量之間的相互作用，能夠從多因素試驗中選擇具有高顯著性水平的最有效因子以便進行更深一步優化[15]。在單因素試驗的基礎上，以游離氨基酸提取量為考察指標，選取超聲時間(A)、超聲功率(B)、乙醇體積分數(C)、液料比(D)、超聲溫度(E)、浸提次數(F)6個因素進行PB試驗，試驗設計如表1所示。

表1 PB試驗因素與水平Table 1 PB test factors and levels

1.3.4 響應面試驗設計

根據PB試驗篩選得到對氨基酸提取量影響較大的3個因素，即超聲時間(A)、乙醇體積分數(C)和超聲溫度(E)，以狹果茶藨子鮮果中氨基酸提取量為考察指標，通過Box-Behnken模型進行響應面試驗，優化提取工藝參數。因素水平見表2。

表2 響應面設計試驗因素與水平Table 2 Response surface design test factors and levels

1.3.5 狹果茶藨子氨基酸提取量的測定

在楊玲引等[16]方法的基礎上，略有改動，測定樣品中氨基酸質量分數。取5 mg/mL的谷氨酸標準品溶液 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL于試管，蒸餾水補至10 mL，移取上述溶液各2 mL于10 mL容量瓶，分別加入磷酸鹽緩沖液2 mL，茚三酮溶液1 mL，搖勻，沸水浴20 min，冷卻后定容，于566 nm處測定吸光度值，得到回歸方程y=1.649 1x-0.011 6，R2=0.995 7。準確移取稀釋到一定濃度的狹果茶藨子果實中游離氨基酸溶液2 mL，按上述標準曲線操作方法測定吸光度，按照回歸方程計算狹果茶藨子中游離氨基酸提取量，如公式(1)所示：

(1)

式中：ρ，狹果茶藨子氨基酸質量濃度，mg/mL；V，提取液總體積，mL；n，稀釋倍數；m，狹果茶藨子鮮果漿液的質量，g。

1.3.6 狹果茶藨子氨基酸的成分分析

將最優工藝參數得到的氨基酸提取液按照GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》采用氨基酸自動檢測儀測定成分組成。

1.4 數據處理

采用Origin 6.0軟件對單因素結果進行處理；采用Design-Expert.V8.0.6軟件對響應面進行模型構建。

2 結果與分析

2.1 狹果茶藨子果實中營養成分測定

狹果茶藨子鮮果中富含營養成分，其中蛋白質是人體必需的營養素，研究表明，植物蛋白含量較高的食物中的脂肪及膽固醇含量往往都很低, 同時含有大量膳食纖維, 正好與動物蛋白食物相反, 更有利于人的身體健康[17]。茶藨子果實中粗纖維含量為(24.4±0.61)%，蛋白質含量為(7.9±0.76)%，同時，糖也是人體所需能量的主要提供者，測得含量為(17.0±0.82)%，而粗脂肪含量很低，為(2.2±0.57)%，屬于典型的低脂高纖維水果，是當代青年的瘦身食源。由表3可知，茶藨子果實含量較高的必需元素依次為K、Ca、P、Mg，其中K的含量高達9 770 μg/g，且K/Na將近280，體現了高鉀低鈉的特點，對于促進新陳代謝、調節血壓、提高免疫等發揮著重要作用[18]。而微量元素攝入不足或過量均會影響機體正常功能。Zn、Fe、Ca、Mn這幾種對人體有益的微量元素含量分別為27.8、215、2 970、6.24 μg/g，綜合分析表明狹果茶藨子不僅具有酸甜爽口的漿果風味，而且營養保健價值頗高。

表3 狹果茶藨子果實中礦質元素含量 單位：μg/gTable 3 Mineral element content in R.stenocarpum fruit

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 超聲波處理時間

由圖1可知，狹果茶藨子鮮果氨基酸提取量隨超聲時間的增加而呈現先增加后減小的趨勢，在30 min時達到峰值，這可能是由于在提取時間為30 min時，狹果茶藨子中的氨基酸已基本被提取出來，故氨基酸含量達到峰值，再延長超聲時間，可能會造成氨基酸結構的改變，氨基酸含量反而下降，因此選取超聲時間30 min為宜。

圖1 超聲時間對狹果茶藨子氨基酸提取量的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on amino acid extraction from R.stenocarpum

2.2.2 超聲波溫度

由圖2可知，狹果茶藨子氨基酸提取量隨超聲溫度的增加呈現先增加后減小的趨勢，45 ℃時游離氨基酸提取量達33.61 mg/g，這可能是因為較高的溫度會導致擴散率增加，相應地使提取效率升高，此外，過高溫度引起的氨基酸降解是導致提取率下降的重要原因。因此選取超聲溫度45 ℃為宜。

圖2 超聲溫度對狹果茶藨子氨基酸提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on amino acid extraction from R.stenocarpum

2.2.3 超聲波功率

由圖3可知，狹果茶藨子果實中氨基酸提取量隨超聲功率的增大而增加，在300 W時達到峰值，當超聲功率不足300 W時，出現上升趨勢。這可能是因為超聲功率的增加，提高了熱效應和空化作用之間的相互協調[19]，利于氨基酸的溶出。當超聲功率>300 W，超聲引起的空化效應得到抑制，從而降低了氨基酸的提取量，故選取超聲功率300 W為宜。

圖3 超聲功率對狹果茶藨子氨基酸提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on amino acid extraction from R.stenocarpum

2.2.4 乙醇體積分數

由圖4可知，狹果茶藨子氨基酸提取量隨乙醇體積分數的增大呈現先增加后減小的趨勢，在40%時達到峰值，這可能是由于相似相溶原理，當乙醇體積分數與氨基酸極性接近時，氨基酸易于溶出，當增大乙醇體積分數后，其他醇溶性物質相繼溶出，導致氨基酸提取量下降，因此選取乙醇體積分數40%為宜。

圖4 乙醇體積分數對狹果茶藨子氨基酸提取量的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on amino acid extraction from R.stenocarpum

2.2.5 液料比

由圖5可知，隨液料比的增加，狹果茶藨子氨基酸提取量呈現不斷增加的趨勢，在35∶1(mL∶g)時達到峰值，這可能是由于溶劑用量不足，氨基酸提取被限制，隨著溶劑用量的加大，狹果茶藨子中氨基酸被充分提出，再增大用量，對提取量影響較小，且造成浪費。因此選取液料比35∶1(mL∶g)為宜。

圖5 液料比對狹果茶藨子氨基酸提取量的影響Fig.5 Effect of liquid-solid ratio on amino acid extraction from R.stenocarpum

2.2.6 浸提次數

由圖6可知，狹果茶藨子氨基酸提取量隨浸提次數的增加而增加，浸提2次后氨基酸提取量達到峰值47.75 mg/g，隨后基本趨于穩定。這可能是因為經過前2次的提取，氨基酸已經基本提取完全，繼續增加浸提次數，對氨基酸提取量影響較小且耗時較久，因此選取2次為最佳浸提次數。

圖6 浸提次數對狹果茶藨子氨基酸提取量的影響Fig.6 Effect of extraction times on the extraction amount of amino acids from R.stenocarpum

2.3 PB試驗結果

PB試驗的結果如表4和表5所示。模型P值為 0.016 1，呈顯著性差異(P<0.05)，具有統計學意義。從各因素的P值可知，影響狹果茶藨子氨基酸提取量的主次因素為：乙醇體積分數>超聲溫度>超聲時間>料液比>浸提次數>超聲功率，其中超聲時間和超聲溫度對狹果茶藨子氨基酸提取量的影響呈顯著(P<0.05)差異，乙醇體積分數呈極顯著差異(P<0.01)，其他因素差異均不顯著(P>0.05)，因此，選擇超聲時間、乙醇體積分數和超聲溫度進行響應面試驗。

表4 PB試驗設計與結果Table 4 PB test design and results

表5 PB 試驗結果分析Table 5 Analysis of PB test results

2.4 響應面優化試驗結果

2.4.1 響應模型建立與分析

根據PB試驗結果，按照表2進行響應面設計，結果見表6。通過Design-Expert軟件展開二次多元回歸擬合，獲得狹果茶藨子氨基酸提取量與超聲波時間、乙醇體積分數、超聲溫度的二次多項式回歸方程：Y=47.57+0.12A-2.12C+0.77E+1.41AC-0.71AE-1.72CE-6.23A2-5.22C2-5.65E2。回歸方程表明，影響狹果茶藨子游離氨基酸提取量的最大因素是乙醇體積分數，其次是超聲溫度、超聲時間。

表6 響應面試驗設計及結果Table 6 Response surface test design and results

表7 回歸模型方差分析Table 7 Analysis of variance of regression model

2.4.2 響應面交互作用分析

通過3D擬合得到等高線圖和響應面圖，便于直觀分析各因素之間交互作用的影響。如圖7所示，試驗考察3個因素中兩兩間所形成的曲面圖均有一定坡度，其中超聲時間與乙醇體積分數、乙醇體積分數與超聲溫度的曲面坡度較陡，等高線圖呈橢圓形，說明超聲時間與乙醇體積分數、乙醇體積分數與超聲溫度兩兩因素間呈現的交互作用均較明顯，而超聲時間與超聲溫度的等高線呈圓形，表明超聲時間和超聲溫度對狹果茶藨子游離氨基酸提取量無顯著影響。通過擬合得到狹果茶藨子游離氨基酸的最佳提取工藝為：超聲時間30.4 min、液料比35∶1(mL∶g)、提取2次、超聲溫度54.8 ℃、超聲功率300 W、乙醇體積分數40.2%，預測狹果茶藨子游離氨基酸提取量可達47.74 mg/g。

圖7 兩因素交互作用對狹果茶藨子氨基酸提取量的影響Fig.7 Effect of the interaction of two factors on the extraction of amino acids from R.stenocarpum

2.4.3 驗證試驗

為驗證該響應面擬合得到的工藝條件是否準確，按此工藝條件進行3次提取，考慮到實際操作條件，將其修正為：超聲時間30 min、液料比35∶1(mL∶g)、提取次數2、超聲溫度55 ℃、超聲功率300 W、乙醇體積分數40%。狹果茶藨子游離氨基酸平均提取量達(47.57±0.67)mg/g，相對標準偏差為0.014 mg/g，與預測值相當，表明利用響應面法建立的回歸模型可較好地預測狹果茶藨子中游離氨基酸的實際提取量。

2.5 狹果茶藨子氨基酸組成與評價

基于現代營養學理論，食物蛋白質氨基酸的種類、數量及組成比例決定著食物本身的營養價值，當氨基酸各組分越接近FAO/WHO模式要求，則該食物的營養價值越高，越有利于人體健康[20]。在FAO/WHO提出的理想蛋白質標準模式中, 當組成蛋白質的必需氨基酸/總氨基酸為0.4左右，必需氨基酸/非必需氨基酸為0.6以上時，表明該食品的營養價值較好[21]。本實驗通過氨基酸自動分析儀測得狹果茶藨子中含有17種氨基酸，結果見表8，其中必需氨基酸總量為1.81 g/100 g，占總游離氨基酸的38.51%，基本符合理想蛋白質標準。在必需氨基酸中苯丙氨酸含量最高，達0.60 g/100 g，非必需氨基酸中谷氨酸含量最高，其次為天冬氨酸、組氨酸、絲氨酸等，這與孫晴等[5]的研究結果較為接近。谷氨酸是中樞神經系統中主要的興奮性神經遞質，不僅能夠提高免疫功能，而且具有調節大腦學習、記憶、認知等功能[22]。天冬氨酸是機體內重要的內源性氨基酸，在調節腸道微生物菌群及肝臟功能衰竭等方面發揮了重要的生物學效應。同時，谷氨酸和天冬氨酸也是重要的鮮味氨基酸，因此，從氨基酸角度分析狹果茶藨子果實具有極其重要的營養價值，可以用來開發成為具有特定功能性的食品。

表8 狹果茶藨子果實中氨基酸組成 單位：g/100 gTable 8 Amino acid composition in R.stenocarpum fruit

3 結論

研究發現，對于天然產物中氨基酸成分的提取，不同的提取方法對其含量具有很大的影響，這可能是由于方法的不同機制導致了氨基酸的未完全溶出或成分的損失。早期主要以傳統的浸提法為主，隨著科學研究的不斷發展，逐漸演變出水浴回流法、微波消解提取法及超聲提取法。較傳統方法而言，這些方法都不同程度地提高了提取效率，優化了提取時間。但微波消解法由于其微波功率的不穩定性以及溫度的不可控性，導致有效成分的結構破壞，而超聲提取法通過自身產生的機械振動作用可以有效避免該不足。因此本研究采用超聲波輔助提取法對青藏高原特色生物資源狹果茶藨子中氨基酸提取工藝進行優化，得到最佳工藝參數為：超聲時間30 min、液料比35∶1(mL∶g)、提取次數為2次、超聲溫度55 ℃、超聲功率300 W、乙醇體積分數40%。此條件下，得到的氨基酸平均提取量為(47.57±0.67)mg/g。通過對氨基酸組分進行分析，根據EAA/TAA和EAA/NEAA 比值, 狹果茶藨子中氨基酸基本滿足FAO/WHO的理想模式，說明其富含人體必需氨基酸, 且組成合理均衡。

通過對狹果茶藨子果實中的營養成分進行測定，發現其果實中蘊含著豐富的對人體有益成分。與常規鮮果如藍莓、桑葚、草莓相比[23-25]，狹果茶藨子果實中的膳食纖維及蛋白質含量均顯著較高，同時脂肪含量偏低，是一種典型的低脂高纖維漿果資源。果實中富含K、Ca、P、Mg等多種有益元素,是補充機體所需礦質微量元素的天然食物來源，營養價值與使用價值較高。目前，對于狹果茶藨子的研究多集中在活性成分上，本試驗填補了營養成分及氨基酸提取工藝參數和組分研究的空缺，為進一步開發與利用我國野生狹果茶藨子資源提供了重要的指導意義。