酒餅葉對豉香型白酒酒餅細菌多樣性影響研究

孫哲，黃芷珊，劉幼強，曹榮冰，黃桂東,3,4,5,6*，鐘先鋒,3,4,5,6

1(佛山科學技術學院 食品科學與工程學院，廣東 佛山，528231)2(廣東省九江酒廠有限公司，廣東 佛山，528203) 3(廣東省傳統發酵食品工程技術研究中心，廣東 佛山，528231)4(廣東省食品流通安全控制工程技術研究中心，廣東 佛山，528231)5(佛山市釀造工程技術研究中心，廣東 佛山，528231)6(佛山市農業生物制造工程技術研究中心，廣東 佛山，528231)

白酒是世界六大蒸餾酒之一，根據生產工藝、糖化發酵劑種類、釀造原料與環境等因素的差異，可將其分為濃香型、醬香型、清香型和豉香型等多種香型[1]。豉香型白酒是廣東珠三角地區的傳統米酒。它以大米為原料，蒸煮后拌入大酒餅并加水入罐發酵，成熟醪經釜式蒸餾后，所得酒被稱為“齋酒”，齋酒陳釀一段時間后再經肥豬肉醞浸，最終形成具有豉香風味的白酒[2]。豉香型白酒醇和細膩、低度清淡的酒體風格，深受我國華南地區和東南亞地區消費者的認可[3]。

酒曲是我國白酒生產中必不可少的糖化發酵劑，在白酒釀造過程中，酒曲微生物的群落結構決定了其代謝產物的種類和數量，同時也決定了白酒風味物質的組成[4]。豉香型白酒的酒曲也稱為酒餅，是由多種藥材、谷物、餅泥、酒餅葉和水進行混合、壓制、發酵而成，其微生物復雜繁多[5]。與其他香型白酒酒曲相比，豉香型白酒酒餅除了生產原料和釀造環境不同外，其獨特之處在于添加了酒餅葉。酒餅葉是豉香型白酒酒餅制作過程中添加的帶有特殊香氣的葉子，屬于中草藥類，其可為酒餅有益微生物補充營養，使之快速成為優勢菌種從而抑制雜菌的繁殖，同時還能引起白酒發酵過程中總酸、還原糖、酒精度等指標的變化，對穩定酒餅的質量具有重要作用[6-7]。研究表明，酒曲中的細菌在白酒釀造過程中具有產香、產酶等功效，其代謝產生的風味物質決定著白酒的品質[8]。因此，探究酒餅葉對豉香型白酒酒餅中細菌群落結構的影響，有利于認識酒餅葉在豉香型白酒釀造過程中的作用。

高通量測序技術具有速度快，準確率高等優點[9]，已廣泛用于白酒、土壤和水資源等微生物群落多樣性的分析[10]。目前，豉香型白酒的研究仍處于發展階段，其酒餅中包括細菌群落結構在內的微生物多樣性尚不清晰，不利于豉香型白酒的更好發展。因此，本研究以添加不同比例酒餅葉獲得的酒餅為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序平臺對細菌的16S rDNA V3～V4區進行測序，分析豉香型白酒酒餅細菌微生物菌群多樣性，明確優勢細菌菌群，以期為更好地提升豉香型白酒品質提供理論依據，對推動豉香型白酒發展具有一定現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

豉香型白酒的酒餅葉主要由肉桂(Cinnamomumcassia)、假鷹爪(Desmoschinensis)等植物葉子組成，為了探究桂葉、假鷹爪葉及傳統工藝中其不同配比情況下對酒餅細菌多樣性的影響，于2021年3月在廣東省某酒廠正常生產車間以不同比例酒餅葉制取6種酒餅樣品，具體比例如表1所示，其中酒餅葉為粉碎成豆粒大小的干葉，添加量為正常制曲工藝物料(不含酒餅葉)的質量分數。

表1 酒餅葉添加質量分數 單位：%Table 1 Add proportion of herbal leaves

生產完畢的6組酒餅分別運送至6個餅房中培養，餅房培養溫度為30～38 ℃，最高品溫48 ℃，培養周期為7 d，結束培養后，在每個餅房中分別從上層、中層和下層各取5個位置感官較好的酒餅[1](酒餅的取樣標準為該酒廠內部酒餅的感官評價標準，評價依據為酒餅表面微白無異色，褶皺均勻，裂口大小適中，曲香正常無異味為感官較好的酒餅)，如圖1-a所示，每個酒餅的取樣點為酒餅四角和中心位置，如圖1-b所示。最后將上層、中層和下層取樣位置的酒餅中5個部位的樣品混合并粉碎均勻作為1個樣品，盡量減少取樣誤差。樣品采集完成后用無菌密封袋包裝立即進行DNA提取。

a-餅層中取樣部位；b-酒餅取樣部位圖1 餅房中酒餅取樣部位示意圖Fig.1 Schematic diagram of Jiuqu sampling in culture room

1.1.2 試劑

D1600 DNA提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；Omega D2500瓊脂糖凝膠回收試劑盒，美國OMEGA公司；MiSeq試劑盒，美國Illumina公司。

1.1.3 儀器

ChemiDoc凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；9700型PCR儀，美國ABI GeneAmp公司；ALLEGRA-64R高速冷凍離心機，美國BECKMAN COULTER公司；VM-01U渦旋振蕩器，美國精騏公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取

將6種酒餅樣品用6臺粉碎機粉碎成粉末，稱取每種樣品各10 g，酒餅中微生物總DNA的提取按照DNA提取試劑盒中說明書的方法進行。

1.2.2 PCR擴增與測序

對細菌的16S rDNA V3～V4區進行測序，引物詳情如表2所示。

表2 細菌PCR擴增引物Table 2 Primers used for PCR amplification of bacterial

細菌PCR體系(20 μL)：5×FastPfu Buffer 4 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μL，Forward Primer (5 μmol/L) 0.8 μL，Reverse Primer(5 μmol/L) 0.8 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，Template DNA 10 ng，補充ddH2O至20 μL；反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s(27次循環)，最后72 ℃延伸10 min，10 ℃后停止。

PCR擴增結束后，利用DNA凝膠回收試劑盒對PCR產物進行定量，最后送到上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Illunina MiSeq高通量測序。

1.3 數據處理

采用Uparse(version 7.0.1090, http://drive5.com/uparse/)軟件在97%相似性對非重復序列進行可操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類分析。基于分類學信息，使用生信云平臺對樣品中物種多樣性信息進行分析，并在特定分類水平上進行群落組成的統計。

2 結果與分析

2.1 酒餅中DNA的提取與定量

提取6個酒餅樣品的DNA，測定其質量濃度與純度，如表3所示。6個酒餅樣品DNA的質量濃度為97.1～152.8 ng/μL，酒餅Q1與Q2之間不顯著(P>0.05)，酒餅Q1與酒餅Q3～Q6之間差異顯著(P<0.05)，說明單獨添加1%的桂葉對質量濃度影響較小，其他比例酒餅葉對質量濃度影響較大。OD260/OD280值為1.71～1.82，酒餅Q1與Q6之間差異顯著(P<0.05)，酒餅Q1與Q2～Q5之間差異不顯著(P>0.05)，說明1%的桂葉和8%的假鷹爪葉混合生產的酒餅對OD260/OD280值影響較大，其他比例酒餅葉對OD260/OD280值影響較小。OD260/OD230值為0.27～0.71，酒餅Q2與Q3、Q4與Q5、Q1與Q6之間不顯著(P>0.05)，酒餅Q4、Q5與Q1、Q6與Q2、Q3之間差異顯著(P<0.05)，說明單獨添加不同比例的桂葉或假鷹爪葉對OD260/OD230值影響較小，不同種類酒餅葉之間的OD260/OD230值影響較大。酒餅DNA質量濃度分析結果表明，不同酒餅之間質量濃度雖有差異，但提取的酒餅DNA濃度較純，適用于酒餅細菌多樣性的分析。

表3 酒餅中DNA質量濃度分析Table 3 Microbial DNA concentrations from Jiuqu

2.2 細菌豐富度和多樣性分析

α多樣性即復雜度，可以反映群落的物種豐富度和微生物多樣性，主要包括OTU數、Shannon指數和Chao指數等，Chao指數越大，代表樣品豐富度越高；Shannon指數越大，代表樣品多樣性越高[11]。6組酒餅樣品中的有效序列數為30 188～35 587，Chao指數為30.74～49，Shannon指數為0.88～1.67，基于97%的相似度其OTU數為28～46，覆蓋率范圍是99.96%～99.98%，充分說明了本研究檢測的OTU能基本反映酒餅樣品的細菌群落組成。由表4可知，酒餅Q1、Q2、Q3反映的是桂葉添加量對酒餅細菌多樣性的影響。酒餅Q1分別與Q2、Q3之間Chao指數差異不顯著(P>0.05)，酒餅Q2與Q3之間差異顯著(P<0.05)，說明單獨添加1%桂葉和單獨添加2%桂葉的酒餅之間細菌菌群豐富度有明顯差異；這3個樣品的Chao指數(細菌菌群的豐富度)隨著桂葉添加量的增加而先降低后升高，說明單獨添加1%的桂葉對其豐富度有一定抑制作用，而單獨添加2%的桂葉對其豐富度有促進作用。酒餅Q1分別與Q2、Q3之間Shannon指數差異顯著(P<0.05)，酒餅Q2與Q3之間差異不顯著(P>0.05)，說明有無桂葉添加的酒餅之間細菌群落多樣性有明顯差異；這3個樣品的Shannon指數逐漸升高，說明在一定范圍內逐漸增加桂葉添加量可以提高酒餅細菌群落多樣性。Chao指數和Shannon指數均說明單獨添加2%的桂葉時，酒餅細菌群落多樣性較為豐富。

表4 酒餅樣品細菌測序數據統計分析Table 4 Statistical analysis of bacterial sequencing data in Jiuqu samples

酒餅Q1、Q4、Q5 3個樣品反映的是假鷹爪葉添加量對酒餅細菌多樣性的影響。酒餅Q1、Q4、Q5之間Chao指數差異顯著(P<0.05)，說明添加假鷹爪葉會對酒餅細菌菌群豐富度產生顯著影響；3個樣品的Chao指數逐漸降低，表明在一定范圍內增加假鷹爪葉添加量對酒餅細菌群落豐富度有抑制作用。酒餅Q1、Q4、Q5之間Shannon指數差異顯著(P<0.05)，說明添加假鷹爪葉會對酒餅之間細菌群落多樣性產生顯著影響；這3個樣品的Shannon指數先升高后降低，說明單獨添加4%的假鷹爪葉對酒餅細菌群落多樣性有促進作用，添加量過高時(8%)會對其細菌群落多樣性有抑制作用。

酒餅Q6是按傳統工藝酒餅葉添加比例生產的酒餅。結果表明，酒餅Q6與其他5組酒餅樣品之間Chao指數差異顯著(P<0.05)，說明其細菌群落豐富度與其他5組樣品之間有明顯差異；酒餅Q6與Q4之間Shannon指數差異不顯著(P>0.05)，與其他4組樣品之間差異顯著(P<0.05)，說明了1%的桂葉和8%的假鷹爪葉混合生產的酒餅與單獨添加4%假鷹爪葉的酒餅之間細菌多樣性差異較小，與其他4組之間細菌多樣性差異較大；同時，6組酒餅樣品中，酒餅Q6的Chao指數和Shannon指數均是最高，說明1%的桂葉和8%的假鷹爪葉混合生產的酒餅能夠顯著提高酒餅細菌群落的豐富度和多樣性。

2.3 細菌群落分布與組成分析

2.3.1 細菌的群落分布

在屬分類水平上，6組酒餅樣品中共檢測出85個細菌屬(相對豐度≥1%)。采用韋恩圖分別統計Q1空白組(KB)、Q2和Q3桂葉組(GY)、Q4和Q5假鷹爪葉組(JY)、Q6傳統工藝組(CT)樣品中共有和獨有的細菌屬。如圖2所示，不同比例酒餅葉制成的6組酒餅中共有細菌屬14個，占細菌屬總數的41.18%；空白組、桂葉組、假鷹爪組之間，桂葉組、假鷹爪葉組、傳統工藝組之間和假鷹爪葉組、傳統工藝組、空白組之間均無共有細菌屬；傳統工藝組與其他組之間均有2個共有菌屬，各組中的特有菌屬分別為空白2個，桂葉0個，假鷹爪4個，傳統工藝5個，其中傳統工藝組的特有菌屬數量最多，說明1%桂葉和8%假鷹爪葉的傳統工藝組酒餅與其他酒餅細菌屬之間具有一定相似性，同時其細菌屬種類最豐富。

圖2 不同分組酒餅樣品細菌屬水平韋恩圖Fig.2 Venn diagram of bacteria in Jiuqu sample at genus level from different groups

2.3.2 細菌群落分組成分析

如圖3所示，在門分類水平上，酒餅樣品中優勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)，其相對豐度大于99%，明顯高于其他菌門。黎江華等[12]研究發現，五味子發酵用酒曲的優勢菌門是厚壁菌門和擔子菌門(Basidiomycota)，其中厚壁菌門的豐富度達到72%，占主導地位；四川郎酒廠研究大曲發酵過程中，變形菌門(Proteobacteria)豐度變小，厚壁菌門豐度增加，厚壁菌門在高溫大曲發酵和儲存過程中起著關鍵作用[13]。本研究豉香型白酒釀造過程中，厚壁菌門也是其酒餅的主要優勢菌門。

圖3 酒餅樣品細菌門水平群落組成Fig.3 Bacterial community composition of Jiuqu samples at phylum level

此研究還發現，豉香型白酒酒餅中的變形菌門相對含量較少，與其他米酒酒曲中變形菌門相對含量比較高的結果不一致。變形菌門中某些菌種具有一定的致病性，如綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)能夠導致甲溝炎的發生[14]；肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)[15]和成團泛菌(Pantoeaagglomerans)[16]對于某些抗生素具有一定的抗性作用，可能引發炎癥；而豉香型白酒酒餅中變形菌門含量較少，在一定程度上避免了類似疾病的發生。

如圖4所示，在屬分類水平上，酒餅樣品中優勢菌屬為乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)和魏斯氏菌屬(Weissella)，相對豐度均大于1%，同時，所有樣品中乳桿菌屬占據較大比例，其相對豐度在75%以上，是酒餅樣品中豐度最高的細菌菌屬。而在其他酒曲中主要優勢細菌群有芽孢桿菌屬、片球菌屬、紅球菌屬、羅爾斯頓菌屬和海洋桿菌屬等，說明豉香型白酒酒餅與其他酒曲中優勢細菌群存在一定的差異[17-18]。

圖4 酒餅樣品細菌屬水平群落組成Fig.4 Bacterial community composition of Jiuqu samples at genus level

由圖4可知，酒餅Q1、Q2、Q3的乳桿菌屬相對豐度隨著桂葉添加量的增加而逐漸減少，說明在一定范圍內逐漸增加桂葉添加量可以降低乳桿菌屬相對豐度。由酒餅Q1、Q4、Q5可知，添加假鷹爪葉可以降低乳桿菌屬的相對豐度，但單獨添加8%假鷹爪葉的酒餅中乳桿菌屬的相對豐度高于單獨添加4%假鷹爪葉的酒餅，即在一定范圍內逐漸增加假鷹爪葉添加量也能夠提高乳桿菌屬相對豐度，表明單獨假鷹爪葉對乳桿菌屬的相對豐度作用效果不明顯。與酒餅Q1相比，Q6的乳桿菌屬相對豐度減少了15.43%，表明1%桂葉和8%假鷹爪葉混合添加對乳桿菌屬豐度具有一定的抑制效果，但同時酒餅Q6中片球菌屬和魏斯氏菌屬的相對豐度有所增加，也表明了此添加比例也能夠豐富酒餅的細菌群落多樣性。即便豐度有所下降，乳桿菌屬仍是各組酒餅中豐度最高的菌屬，其在酒餅中的重要作用是不可忽視的。乳桿菌屬是乳酸菌中的重要菌屬之一，研究認為乳酸菌具有促進美拉德反應、酵母發酵和維持釀酒生態環境等作用，其主要代謝產物乳酸是形成乳酸乙酯和一些其他香味物質的重要物質[19]。張艷等[20]研究發現，乳桿菌可促進酵母生長代謝，以維持和促進主要酵母在白酒發酵過程中的優勢地位，從而影響著白酒中的酸類、酯類和醇類等一些風味物質的形成，促進白酒品質提升。

片球菌屬的相對豐度為6.49%～11.53%，也是豉香型白酒酒餅中的優勢菌屬之一，在海南山蘭米酒酒曲[21]和建始地區米酒酒曲[22]中也發現一定豐度的片球菌屬，可見，片球菌屬在酒曲中具有重要作用。由Q1～Q5組片球菌屬分布圖可知，單獨添加桂葉或單獨添加假鷹爪葉均可以增加片球菌屬的豐度，其變化趨勢為：隨著桂葉添加量的增加，片球菌屬豐度增幅減小，說明在一定范圍內逐漸增加桂葉添加量可以降低片球菌屬相對豐度；隨著假鷹爪葉添加量的增加，片球菌屬豐度增加，說明在一定范圍內逐漸增加假鷹爪葉添加量可以提高片球菌屬相對豐度；而通過分析酒餅Q1和Q6發現，Q6組酒餅的片球菌屬豐度雖不如單獨添加桂葉和假鷹爪葉的Q2～Q5組，但其總體豐度還是高于空白組酒餅Q1，說明1%桂葉和8%假鷹爪葉混合組提高片球菌屬豐度的效果低于單獨添加桂葉組或假鷹爪葉組。

魏斯氏菌屬的相對豐度為1.01%～14.95%，通過酒餅Q1與其他5組酒餅對比可知，添加酒餅葉即可增加魏斯氏菌屬相對豐度；由Q1、Q2和Q3組可知，在一定范圍內逐漸增加桂葉添加量可以提高魏斯氏菌屬相對豐度；由Q1、Q4和Q5組可知在一定范圍內逐漸增加假鷹爪葉添加量可以降低魏斯氏菌屬相對豐度；酒餅Q6中魏斯氏菌屬相對豐度是空白組Q1的14倍左右，說明1%桂葉和8%假鷹爪葉混合組酒餅可以顯著提高魏斯氏菌屬豐度。沈馨等[23]將孝感地區3個鳳窩酒曲作為研究對象對其細菌菌群結構進行研究，結果發現魏斯氏菌屬是其9個優勢核心菌群之一，平均相對含量為12.15%，在核心菌屬中排名第3位，這表明魏斯氏菌屬也是其他酒曲的優勢菌屬。

2.4 細菌微生物群落相似性分析

主成分分析可以直觀地在坐標圖上表示出樣品之間的相似性或差異性，點間距越小表明相似性越高[24]。如圖5-a所示，主成分1和主成分2解釋了酒餅樣品中86.02%和8.45%的細菌群落信息，兩成分之和大于80%，可以反映樣品中的細菌群落信息。酒餅Q2、Q3、Q5樣品之間距離最近，差異性不大，說明單獨添加1%、2%的桂葉或8%的假鷹爪葉的酒餅可以形成相似的細菌群落；酒餅Q1分別與Q2、Q3、Q5和酒餅Q4、Q6之間距離較遠，說明不添加任何酒餅葉的酒餅與添加酒餅葉的酒餅之間差異性較大，細菌群落相似性低；酒餅Q1與Q6之間的距離最遠，同時也說明了1%的桂葉和8%的假鷹爪葉混合生產的酒餅更能豐富酒餅細菌群落豐度，與細菌群落豐度和多樣性的研究一致。

圖5 細菌群落主成分分析(a)和β多樣性距離的樣本層級聚類樹(b)Fig.5 Principal coordinate analysis diagram of bacterial communities (a) and hierarchical clustering tree of β diversity distance (b)

通過對酒餅樣品細菌β多樣性距離矩陣進行層級聚類分析，構建樣品的層級聚類樹，根據不同的距離閾值可以將樣品劃分為凝聚的小組，從而研究樣品之間的相似性和差異性[25]。圖5-b中，β多樣性分析結果與主成分分析結果相似。酒餅Q2與Q3、Q5的細菌屬聚為一類，親緣關系較近，說明單獨添加1%、2%的桂葉或8%的假鷹爪葉酒餅具有相似的細菌群落結構；酒餅Q1分別與酒餅Q2、Q3、Q5和酒餅Q4、Q6聚為不同類，親緣關系較遠，說明不添加任何酒餅葉的酒餅與添加酒餅葉的酒餅之間細菌群落差異性較大，同時也說明了添加一定比例的酒餅葉可以形成不同的細菌群落結構，對于酒餅的細菌多樣性具有重要作用。

3 結論

本文采用高通量測序技術對豉香型白酒酒餅中的細菌群落多樣性進行分析，由不同組合的酒餅葉對細菌多樣性的影響進行了評估及優勢菌群組成進行了初步判定。結果發現，單獨添加2%的桂葉對酒餅細菌群落豐富度有促進作用；單獨添加4%的假鷹爪葉對酒餅細菌群落多樣性有促進作用；1%的桂葉和8%的假鷹爪葉混合生產的酒餅能夠顯著提高酒餅細菌群落的豐富度和多樣性。在門分類水平上，厚壁菌門是豉香型白酒酒餅的主要優勢菌門；在屬水平上，主要優勢細菌屬是乳桿菌屬、片球菌屬和魏斯氏菌屬，與其他酒曲中細菌優勢菌群存在一定的差異。在酒餅中添加酒餅葉能夠降低乳桿菌屬相對豐度，提高片球菌屬和魏斯氏菌屬的相對豐度，其中1%桂葉與8%假鷹爪葉混合添加可以明顯提高魏斯氏菌屬的相對豐度以及降低乳桿菌屬相對豐度，單獨添加1%桂葉的酒餅可以顯著提高片球菌屬的相對豐度。此外，6組酒餅樣品中還存在一部分未鑒定的其他菌屬，表明酒餅中還有豐富的未知菌有待進一步挖掘。通過細菌群落組成、豐富度和相似性等分析發現酒餅葉對于豉香型白酒酒餅的細菌群落多樣性具有重要影響，該研究結論對豉香型白酒的生產具有積極的理論和實踐意義。