干擾lncRNA XIST 通過上調miR-429 抑制涎腺腺樣囊性癌細胞生長并提高順鉑敏感性

張璇 馬里程 孫龍嘯 張磊

腺樣囊性癌（ACC）又稱圓柱瘤或圓柱瘤型腺癌，ACC 占涎腺腫瘤的5%～10%，在涎腺惡性腫瘤中占24%。涎腺ACC（SACC）是生長緩慢但惡性程度高的涎腺上皮性腫瘤，好發于腮腺、頜下腺、舌下腺以及腭腺等小涎腺，具有局部侵襲性強、血行性轉移率高、長期預后差等典型生物學特征。鉑類藥物作為ACC 的一種治療方法已被廣泛探索，但收效甚微。研究表明，組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACi）-亞依洛尼酰胺異羥肟酸和順鉑（DDP）的聯合治療通過激活細胞衰老來消耗腫瘤干細胞并有效降低ACC 原代細胞的腫瘤活性。有研究表明，沉默長鏈非編碼RNA（lncRNA）X 非活性特異轉錄本（XIST）抑制非小細胞肺癌的生長并提高DDP 藥物的敏感性。lncRNA XIST 參與了胃癌細胞耐藥的發生，而其在SACC 中的作用尚未見報道。有研究表明，在多種癌癥中miRNA（miR）- 429 表達下調，發揮抑癌作用，但其在ACC 中的作用未見報道。miR-429是參與口腔鱗癌DDP 耐藥的關鍵miRNA。本研究旨在探索干擾lncRNA XIST 是否能通過上調miR-429 來影響SACC 細胞的生長和對DDP 的敏感性。

材料與方法

一、材 料

人SACC 細胞系SACC-83、ACC-2 和正常下頜下腺細胞HSG 均購于中國科學院上海生命科學學院細胞資源中心。1640 培養基、胎牛血清均購于Sigma 公司，TRIzol 購于Ambion 公司，RT 試劑盒購于TaKaRa 公司。Lipofectamine 2000 購于Invitrogen 公司，shRNA-XIST、 shRNA-NC、mimic-NC、miR-429 mimic、 NC inhibitor 和miR-429 inhibitor由廣州銳博生物科技有限公司合成。CCK-8 試劑盒、Quick Mutation基因定點突變試劑盒和TUNEL 試劑盒均購于上海碧云天生物技術有限公司。雙螢光素酶報告基因載體、螢光素酶檢測試劑盒均購于Promega 公司。抗體購于Cell Signaling Technology公司。

二、方 法

1. 細胞培養

將人SACC 細胞系SACC-83、ACC-2 和正常下頜下腺細胞HSG 以及DDP 耐藥 SACC-83/DDP細胞置于RPMI-1640 培養基中，加入 10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素，放進37 ℃、5% CO飽和濕度的細胞培養箱培養。親代的SACC-83 細胞持續暴露于DDP 12 個月，通過增加DDP 濃度從 0.5 μg/mL 直至細胞獲得10 μg/mL的耐藥性。

2. 細胞轉染及實驗分組

SACC-83 細胞和SACC-83/DDP 細胞中相關質粒根據脂質體2000 轉染試劑操作說明進行轉染。在探究lncRNA XIST 對細胞生長和藥物敏感性的作用時，將兩種shRNA-XIST（shRNA-XIST#1：5′-GU GCGUACAGUGCUGUACAGCAU-3′，shRNA-XIST#2：5′-GCTGACTACCTGAGATTTAAG-3′）及其對照shRNA-NC（5′-UACGCUCAGCAUGUGUCACUC-3′）質粒轉染進SACC-83 細胞，分別記作SACC-83組、shRNA-NC 組、shRNA-XIST#1 組和shRNA-XIST#2組；將上述干擾效力更顯著的組別進行后續實驗、記作shRNA-XIST 組，并將shRNA-XIST 質粒轉染進SACC-83/DDP 細胞，記作SACC-83/ DDP組、SACC-83/DDP+shRNA-NC組和SACC-83/DDP +shRNA-XIST 組； 將mimic-NC（5′-UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT-3′）和miR-429 mimic（5′-UGCCAA AAUGGUCUGUCAUAAU-3′）轉染進SACC-83 細胞，記作mimic-NC 組和miR-429 mimic 組；在探究lncRNA XIST 通過miR-429 對細胞生長和藥物敏感性的調節作用時，將shRNA-XIST 和miR-429 inhibitor（5′-ACGGUUUUACCAGACAGUAUUA-3′）及其對照（5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA-3′）轉染進SACC-83 細胞，記作shRNA-XIST+ miR-429 inhibitor 組及shRNA-XIST+NC inhibitor 組。

3. 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測

采用TRIzol 試劑盒提取細胞中總RNA，根據逆轉錄試劑盒操作說明合成cDNA。在ABI7500 qPCR 系統上根據SYBRGreen 核酸熒光染料進行qPCR 檢測，記錄Ct 值。采用2法計算目的基因的RNA 水平。每組設3 個復孔，實驗獨立重復操作3 次。

4. CCK-8 實驗

將細胞接種于96 孔細胞培養板中，放進細胞培養箱中培養。根據分組處理細胞后，分別在0、24、48 和72 h 加入CCK-8 溶液10 μL/孔，繼續放入培養箱中孵育2 h 后，在酶標儀上設定波長450 nm 檢測細胞的吸光值并繪制細胞生長曲線，計算細胞活力=［（OD-OD）/ OD］×100%。每組設3 個復孔，實驗獨立重復操作3 次。

5.克隆形成試驗

在指定條件下處理細胞，并將其接種于12 孔板（100 個細胞/孔），培養2 周后，用0.05%結晶紫（上海碧云天生物技術有限公司）染色細胞集落，并在熒光顯微鏡下觀察并計數。每組設3個復孔，實驗獨立重復操作3 次。

6. TUNEL 檢測

轉染48 h 后的細胞，加入50 μL 的TUNEL 反應混合液，在黑暗室溫環境放置1 h。用DAB 染色后，再用蘇木精復染，沖洗，采用乙醇梯度脫水、二甲苯用來使玻片透明、封片。光學顯微鏡拍照計數。每組設3 個復孔，實驗獨立重復操作3 次。

7. 蛋白免疫印跡法檢測

收集細胞，用PBS 清洗2 次，采用RIPA 溶液提取細胞中蛋白樣品并測定蛋白濃度。用SDSPAGE 分離20 μg 蛋白樣品，轉移到PVDF 膜上封膜2 h，在4 ℃條件下孵育一抗（1∶1000）過夜。用TBST 洗膜3 次后，二抗（1∶2000）孵育1 h，ECL 發光試劑孵育PVDF 膜10～30 s 后立即放入ECL 成像儀中顯色。每組設3 個復孔，實驗獨立重復操作3 次。

8. 雙熒光素酶報告檢測

使用脂質體2000 轉染試劑將野生型和突變型lncRNA XIST 的熒光素酶表達載體（XIST WT 組和XIST MUT 組）與miR-429 mimic 及mimic-NC 分別轉染48 h 后，根據熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明進行操作，并記錄結果。每組設3 個復孔，實驗獨立重復操作3 次。

三、統計學處理

使用GraphPad Prism 7.0 對所有數據進行統計分析。數據符合正態分布，均以 描述。多組間差異采用單因素和雙因素方差分析，采用Turkey進行事后檢驗。以P ＜ 0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、干擾lncRNA XIST 抑制SACC 細胞增殖并促進其凋亡

RT-qPCR 檢測結果顯示，lncRNA XIST 在SACC細胞系中表達水平高于HSG 細胞（P ＜ 0.001，P =0.007，圖1A），以SACC-83 細胞表達水平最高，選其進行后續實驗。與shRNA-NC 對照組相比，shRNA-XIST#1 組和shRNA-XIST#2 組lncRNA XIST 的表達水平降低（P = 0.001，P ＜ 0.001，圖1B），通過均值比較發現shRNA-XIST#2 組的抑制效果優于shRNA-XIST#1 組（P = 0.020，圖1B），因此選取shRNA-XIST#2 組進行后續實驗，并記作shRNA-XIST 組。CCK-8 法檢測結果顯示相對于shRNA-NC 對照組，shRNA-XIST 組在轉染48 h和72 h 后抑制細胞活力（P = 0.020，P ＜ 0.001，圖1C）；克隆形成試驗結果顯示相對于shRNA-NC對照組，shRNA-XIST 組抑制了細胞增殖能力（P ＜0.001，圖1D）；TUNEL 檢測和蛋白免疫印跡法結果顯示相對于shRNA-NC 對照組，shRNA-XIST 組細胞凋亡率增加（P 均＜ 0.001，圖1E～H）。以上結果表明，敲降lncRNA XIST 可抑制SACC 細胞增殖并促進其凋亡。

圖1 敲降lncRNA XIST 對SACC 細胞增殖和凋亡的作用

二、干擾lncRNA XIST 提高了SACC-83 對DDP的敏感性

RT-qPCR 檢測結果顯示，相對于SACC-83 組，SACC-83/DDP 組中lncRNA XIST 表達水平升高；相對于SACC-83/DDP+shRNA-NC 組，SACC-83/DDP+shRNA-XIST 組降低了細胞中的lncRNA XIST表達水平（P 均＜ 0.001，圖2A）。CCK-8 法檢測發現用高于20 μg/mL 的DDP 分別干預SACC-83組和SACC-83/DDP 組細胞后，SACC-83/DDP 組的細胞活力高于SACC-83 組的細胞活力（P ＜ 0.001，圖2B）；而相對于SACC-83/DDP+shRNA-NC 組，SACC-83/DDP+shRNA-XIST 組抑制了高于40 μg/mL DDP 干預的細胞活力（P = 0.003，P = 0.008，圖2B）。TUNEL 檢測和蛋白免疫印跡法結果顯示，相對于SACC-83 組，SACC-83/DDP 組細胞凋亡率下降；相對于SACC-83/DDP+shRNA-NC 組，SACC-83/DDP+shRNA-XIST 組促進細胞凋亡（P = 0.002，P ＜ 0.001，圖2C～2D）。以上結果說明敲降lncRNA XIST 促進了SACC 細胞對DDP 的敏感性。

圖2 敲降lncRNA XIST 對SACC-83 DDP 敏感性的作用

三、 lncRNA XIST 與miR-429 相互作用

通過LncBase Predicted v.2 預測lncRNA XIST和miR-429 的結合位點（圖3A）。RT-qPCR 檢測結果顯示，在SACC-83 細胞中miR-429 表達水平低于HSG 細胞（P 均＜ 0.001，圖3B）。相對于mimic-NC 組，miR-429 mimic 組在SACC-83 細胞中miR-429 水平上調（P ＜ 0.001，圖3C）。XIST MUT或XIST WT 與miR-429 mimic 或mimic-NC 共轉染到細胞中，與mimic-NC+XIST WT 相比，miR-429 mimic +XIST WT 組熒光素酶活性降低，而mimic-NC+XIST MUT 組和miR-429 mimic +XIST MUT 組則無明顯差異（P ＜ 0.001，圖3D）。并且RT-qPCR結果顯示，相對于shRNA-NC 組，shRNA-XIST 組上調了miR-429 表達水平（P ＜ 0.001，圖3E）。上述結果表明，在SACC 細胞中lncRNA XIST 靶向負調節miR-429 的表達。

圖3 lncRNA XIST 與miR-429 相互作用

四、下調miR-429 表達逆轉了shRNA-XIST對SACC 細胞增殖的抑制作用

在SACC-83 細胞轉染miR-429 inhibitor，相對于NC inhibitor組成功敲降miR-429的表達（P ＜ 0.001，圖4A）。通過CCK-8 法和克隆形成試驗檢測發現，相對于shRNA-XIST+NC inhibitor 組， shRNAXIST+miR-429 inhibitor 組細胞活力在72 h 增加，增殖能力上升（P = 0.02，P ＜ 0.05，圖4B～4C）。TUNEL 檢測結果顯示，相對于shRNA-XIST+NC inhibitor 組，shRNA-XIST+miR-429 inhibitor 組細胞凋亡率下降（P ＜ 0.001，圖4D）。蛋白免疫印跡法結果顯示，相對于shRNA-XIST+NC inhibitor 組，shRNA-XIST+miR-429 inhibitor 組抗凋亡蛋白水平上升，促凋亡蛋白水平下降（P 均＜ 0.001，圖4E）。以上結果表明敲降miR-429 表達可以逆轉shRNAXIST 對SACC 細胞增殖的抑制作用。

圖4 shRNA-XIST 通過miR-429 對SACC 細胞增殖和凋亡的作用

五、下調miR-429 表達逆轉了shRNA-XIST對SACC 細胞DDP 敏感性

CCK-8 法檢測結果顯示，在用高于40 μg/mL的DDP處理細胞時，相對于SACC-83/DDP+shRNAXIST+NC inhibitor組，SACC-83/DDP+shRNA-XIST+miR-429 inhibitor 組促進了細胞活力（P = 0.004，圖5A）。TUNEL 檢測結果顯示，相對于SACC-83/DDP+shRNA-XIST+NC inhibitor 組，SACC-83/DDP+shRNA-XIST+miR-429 inhibitor 組抑制了細胞凋亡水平（P = 0.008，圖5B～5C）。蛋白免疫印跡法結果顯示，相對于SACC-83/DDP+shRNA-XIST+NC inhibitor 組，SACC-83/DDP+shRNA-XIST+miR-429 inhibitor 組抗凋亡蛋白水平上升，促凋亡蛋白水平下降（P = 0.002，P = 0.029，P ＜ 0.001，圖5D）。以上結果表明敲降miR-429 表達可以逆轉shRNAXIST 對SACC 細胞的耐藥作用。

圖5 shRNA-XIST 通過miR-429 對SACC 細胞DPP 敏感性的作用

討 論

ACC 是一種發生在分泌腺內的惡性腫瘤，最常見于頭頸部的唾液腺。SACC 起源于導管、肌上皮、基底細胞，約占主要唾液腺惡性腫瘤的25%，約50%位于小腺體，是一種特殊的惡性腫瘤以其緩慢但滲透式的增長而聞名，沒有明顯的邊界。lncRNA 和microRNA 在各種惡性腫瘤的發生發展過程中均發揮著復雜而廣泛的作用，包括影響腫瘤細胞的增殖、轉移、凋亡及藥物敏感性。本研究發現lncRNA XIST 在SACC 細胞中表達水平上調，影響腫瘤細胞的生長和對DDP 的耐藥性。

XIST 是一種由XIST 基因編碼的lncRNA，在哺乳動物中負責X 染色體失活。lncRNA XIST 參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移以及對化學治療和放射治療的抵抗，如胃癌、膀胱癌和甲狀腺癌等。同時沉默lncRNA XIST 抑制非小細胞肺癌和胃癌的生長并促進對DDP 的敏感性。而本研究發現，在SACC 細胞系中，敲降lncRNA XIST 表達可以抑制細胞活力、克隆形成并促進細胞凋亡，同時提高了細胞對DDP 的敏感性。

lncRNA XIST 被證明可以調節多種miRNA，如miR144-3p、miR-137、miR-367、let-7 和miR-92b，從而調節Notch-1、PXN、ZEB2、BAG-1、Smad7 等多種基因的表達。通過LncBase Predicted v.2 預測lncRNA XIST 能夠和miR-429 結合。有研究表明，miR-429 在多種癌癥中發揮抑癌作用，但在ACC中的作用尚未見報道。miR-429 在口腔鱗癌DDP耐藥中發揮重要的作用。本研究發現miR-429 在SACC 細胞中表達下調，且能夠被lncRNA XIST 靶向負調控，進一步研究發現lncRNA XIST 可通過靶向miR-429 參與SACC 細胞的生長并影響DDP藥物敏感性。

綜上所述，本研究表明lncRNA XIST 在SACC細胞增殖、凋亡和藥物敏感性中起重要作用，為治療SACC 提供了診斷和治療的潛在靶點。