蔡興銳 黃芬 劉韻 許丹妮 曾江正

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，海南 海口 570102)

惡性腹水是由各種惡性腫瘤引起的腹水，50%左右的晚期或復(fù)發(fā)惡性腫瘤患者在其病程中可能出現(xiàn)惡性腹水[1]。目前，化療、腹腔穿刺術(shù)、利尿劑和腹腔分流術(shù)等是臨床上治療腹水癥狀常用方法，但這些療法會產(chǎn)生許多副作用[2]。因此，尋找更有效的治療方法已成為當(dāng)前研究的主要任務(wù)。越來越多的證據(jù)表明，中醫(yī)藥為治療惡性腹水提供可能途徑[3]。研究表明，中藥能減輕部分腫瘤患者抗腫瘤治療的毒副作用[4]。石見穿系唇形科鼠尾草屬華鼠尾草Salvia chinensis benth的干燥地上部分，具有清熱解毒、活血鎮(zhèn)痛之功能，主治肝炎、腎炎、痛經(jīng)、噎隔、痛腫、癌癥等[5]。天然植物多糖具有較好的免疫調(diào)節(jié)活性，還能促進(jìn)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此本研究通過石見穿多糖(Polysaccharides from salvia chinensis benth, PSSC)成分的有效提取，建立H22荷瘤小鼠腹水模型，探究其對肝癌腹水的抑制作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要藥物與試劑 石見穿藥材購自湖北省中藥材有限公司，按文獻(xiàn)[6]方法提取PSSC，溶于生理鹽水備用；小鼠肝癌 H22 細(xì)胞株由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞典藏中心提供；刀豆蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS) 購自美國Sigma公司產(chǎn)品；環(huán)磷酰胺(CTX)、CCK8購自長春百金生物工程有限公司；白介素2(IL-2)、γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；Tunel檢測試劑盒、Caspase3/8試劑盒購自南京凱基生物公司；GAPDH、Janus激酶1(Jak1)、信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3(Stat3)、Bcl2-相關(guān)X蛋白(Bax)，B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)一抗抗體購自美國Abbkines公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 BALB/c小鼠80只，體質(zhì)量(18±2)g，購自南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SYXK(湘)2018-0021。實(shí)驗(yàn)前于(25±1)℃和(55±5)%相對濕度適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，以12 h光照/12 h避光交替循環(huán)飼養(yǎng)，所有小鼠均自由攝食、飲用蒸餾水。該實(shí)驗(yàn)小鼠的處理符合動物倫理要求，并獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及模型建立 取對數(shù)生長期的H22細(xì)胞，以1×106個(gè)/mL的濃度重新懸浮在鹽水中，在左腹腔中注射0.2 mL細(xì)胞懸浮液。H22荷瘤小鼠80只隨機(jī)分為5組：對照組、CTX組及PSSC組(20、40和120 mg/kg PSSC)，每組16只。對照組給予等量生理鹽水；CTX組給予20 mg/kg CTX；PSSC組給予20、40和120 mg/kg PSSC。荷瘤次日給藥，給藥方法為隔天腹腔注射PSSC，共7次。每天測量小鼠腹部周長和體重，在第18天時(shí)處死一半小鼠，取脾臟、血清和腹水，其余小鼠正常喂養(yǎng)，記錄存活時(shí)間。

1.3.2 脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 采用無菌技術(shù)，粉碎小鼠脾臟，離心800×g 30 min，分離脾細(xì)胞，將細(xì)胞洗滌并重新懸浮于RPMI-1640培養(yǎng)基中。將脾細(xì)胞懸液培養(yǎng) 24 h后，分成實(shí)驗(yàn)組和對照組，以1×106個(gè)/mL濃度接種于96孔板中，分別加入ConA 2 mg/L和LPS 5 mg/L，細(xì)胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h，將CCK8試劑添加到每孔(20 μL/孔)中，再孵育2 h，450 nm處測量每孔中脾淋巴細(xì)胞的吸光度。模擬指標(biāo)計(jì)算如下：刺激指數(shù)(SI)=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照組吸光度值×100%。

1.3.3 E-花環(huán)實(shí)驗(yàn) 依據(jù)1.3.2操作，提取各組小鼠的脾淋巴細(xì)胞，用Hanks液配成1×106個(gè)/mL細(xì)胞懸液，每只小試管加入 0.1 mL脾淋巴細(xì)胞懸液，再加0.1 mL 1% 綿羊紅細(xì)胞(SRBC)和0.05 mL滅活FBS，然后低速離心混合物，4℃過夜。次日用0.8%戊二醛在冰上固定細(xì)胞30 min，在高倍顯微鏡下觀察。能夠結(jié)合三個(gè)或更多的T細(xì)胞SRBCs被認(rèn)為是陽性對照。隨機(jī)抽取5個(gè)視野中不少于200個(gè)淋巴細(xì)胞計(jì)算花環(huán)形成率(EtRFC)。

1.3.4 血清和腹水細(xì)胞因子分析 取小鼠眼眶血，分離血清進(jìn)行細(xì)胞因子分析；提取腹水離心，收集上清液，按ELISA試劑盒說明書操作，檢測IL-2、IFN-γ、TNF-α、VEGF水平。

1.3.5 TUNEL法檢測H22細(xì)胞凋亡 PSSC處理(1、2、4 mg/mL)H22細(xì)胞24 h后，4%多聚甲醛固定30 min，用PBS洗滌后，加入10%蛋白酶K孵育20 min，然后加入50 μL TDT溶液37℃孵育1 h，PBS洗滌后，加入50 μL Tritc染色劑37℃下孵育30 min，用DAPI(4,6-二氨基-2-苯基吲哚)染色細(xì)胞核，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

1.3.6 比色法測定Caspase-3和Caspase-8活性 按試劑盒說明書步驟收集細(xì)胞、處理檢測樣品，在酶標(biāo)儀激發(fā)波長405 nm處測定吸光度(A)值，相對活性(%)=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。

1.3.7 Western blot檢測Jak1、Stat3、Bax和Bcl-2蛋白 將H22細(xì)胞(1×105個(gè)/mL)接種于6孔平板中，用不同濃度的PSSC(1、2、4 mg/mL)孵育48 h，然后預(yù)冷的PBS中洗滌2次，通過BCA法檢測蛋白濃度，然后用8%或12%十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS/PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉，加入Jakl、Stat3、Bcl-2、Bax和GAPDH的多克隆抗體4℃下孵育過夜，TBST洗膜，加入HRP 標(biāo)記的二抗稀釋液孵育，采用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色反應(yīng)，并使用GEDOC 2000系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 PSSC在體內(nèi)抗腫瘤作用 將H22細(xì)胞移植到小鼠左腹腔，用不同劑量PSSC(20、40、120 mg/kg)和CTX 20 mg/kg處理。5 d后，接種腫瘤細(xì)胞的對照組小鼠出現(xiàn)明顯的腹脹，而注射PSSC的小鼠則沒有腹脹。7 d后，對照組小鼠腹水增多，腹部隆起明顯，開始出現(xiàn)飲水和進(jìn)食困難，變得懶惰，毛發(fā)沒有光亮，體重和腹部周長迅速增加。第13天，對照組小鼠腹部隆起呈球形，小鼠無動于衷，幾乎不活動，開始死亡(圖1A)。接種后測量小鼠腹部周長和體重結(jié)果，與對照組相比，PSSC組的腹部周長和體重顯著下降，且PSSC 40、120 mg/kg組腹部周長和體重均低于CTX組(P<0.05)(圖1B、1C)；與對照組相比，PSSC組的存活率和存活時(shí)間(在第50天結(jié)束時(shí))呈劑量依賴性增加，且PSSC組小鼠存活率和存活時(shí)間均高于CTX組(P<0.05)，見圖1D、1E。

圖1 PSSC對H22惡性腹水小鼠模型的影響

2.2 PSSC對脾淋巴T細(xì)胞增殖影響 采用ConA和LPS誘導(dǎo)H22腫瘤小鼠淋巴細(xì)胞增殖，與對照組相比，PSSC組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖量(SI)隨PSSC治療劑量的增加而增加，而與CTX組相比，PSSC 120mg/kg組SI升高(均P<0.05)，見圖2。

圖2 PSSC對淋巴細(xì)胞增殖影響

2.3 PSSC對淋巴細(xì)胞玫瑰花結(jié)形成影響 T細(xì)胞CD2受體能特異性結(jié)合SRBC并形成特征性的花環(huán)(圖3A)。各組玫瑰花結(jié)形成率結(jié)果顯示，與對照組相比，PSSC組EtRFC(E-玫瑰花結(jié)形成細(xì)胞的比率)百分比呈劑量依賴性增加，而與CTX組相比，PSSC 120 mg/kg組EtRFC百分比升高(P<0.05)，見圖3B。

圖3 PSSC對淋巴細(xì)胞玫瑰花結(jié)形成率影響

2.4 PSSC對血清和腹水細(xì)胞因子水平的影響 PSSC組H22腫瘤小鼠血清和腹水中的IL-2、IFN-γ和TNF-α水平較對照組增加，而VEGF表達(dá)降低，均呈劑量依賴性；PSSC 120mg/kg組小鼠血清和腹水中的IL-2、IFN-γ和TNF-α水平均高于CTX組，而VEGF表達(dá)水平低于CTX組(均P<0.05)，見圖4。

圖4 PSSC對各組小鼠血清和腹水細(xì)胞因子影響

2.5 PSSC誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡 TUNEL實(shí)驗(yàn)中，非凋亡細(xì)胞經(jīng)DAPL染色呈藍(lán)色核熒光，凋亡細(xì)胞經(jīng)TRITC染色呈強(qiáng)紅色熒光。與對照組相比，PSSC組H22細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，呈劑量依賴性，見圖5。

圖5 TUNEL法檢測H22細(xì)胞凋亡(400×)

2.6 PSSC體外抗腫瘤活性分析 用Caspase比色法測定PSSC處理的H22細(xì)胞Caspase-3和Caspase-8酶活性，與對照組相比，PSSC誘導(dǎo)H22細(xì)胞Caspase-3和Caspase-8活化，且隨著PSSC濃度的增加而表達(dá)上升，見圖6。

圖6 Caspase-3和Caspase-8在H22細(xì)胞中的相對活性

2.7 Wester blot檢測Jak1、Stat3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 隨著PSSC濃度的增加，PSSC組Jak1、Stat3和Bcl-2蛋白表達(dá)較對照組降低，而Bax/Bcl-2比值上升，見圖7。

圖7 PSSC對Caspase-3和Caspase-8活化及其它相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

惡性腹水是惡性腫瘤病情惡化或預(yù)后不良的標(biāo)志，也是引起腫瘤患者死亡的常見原因之一[7-9]。目前腫瘤治療方法主要為手術(shù)、化療、放療，但是這些方法具有副作用較強(qiáng)，治療費(fèi)用高昂等缺點(diǎn)[10]。目前反復(fù)穿刺仍是治療惡性腹水的常用方法，但效果有限，且這些方法只是緩解癥狀，并不能解決根本問題。

研究表明，從中草藥中分離出來的多糖具有多種生物功能[11]。石見穿作為中草藥中的一種，各部位提取物對多種癌細(xì)胞具有一定的抗腫瘤作用[12-13]。由于多糖的毒副作用小，目前已成為研究熱門領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)通過觀察石見穿多糖對H22荷瘤小鼠治療效果，以及對各種細(xì)胞因子表達(dá)影響，探討其抗肝腹水的可能機(jī)制，為臨床治療肝腹水提供一定的參考。

本研究發(fā)現(xiàn)CTX組小鼠的生存時(shí)間較中、高濃度PSSC組明顯降低。PSSC組的腹部周長和體重較對照組顯著下降，存活率和存活時(shí)間較對照組呈劑量依賴性增加。這些結(jié)果均表明PSSC在H22腫瘤模型中具有一定的抗腫瘤作用。

脾臟和胸腺是動物主要的中樞免疫器官，是T細(xì)胞發(fā)育、成熟的場所，在細(xì)胞免疫系統(tǒng)的建立中具有重要作用[14-15]。ConA對T淋巴細(xì)胞具有絲裂原作用，可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞體外增殖。PSSC對脾淋巴T細(xì)胞增殖影響發(fā)現(xiàn)，脾臟淋巴細(xì)胞增殖量(SI)隨PSSC治療劑量的增加而增加，這說明PSSC能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，而在CTX的作用下，小鼠脾臟SI均顯著降低，說明CTX抑制ConA和LPS 刺激的脾臟淋巴細(xì)胞增殖作用；E-花環(huán)實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，PSSC組EtRFC呈劑量依賴性增加，這說明PSSC具有促進(jìn)T細(xì)胞增殖作用，通過T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ等)發(fā)揮抗癌作用。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫功能失調(diào)有密切相關(guān)[16-17]。IL-2主要是由激活的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子，其主要生理功能是促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖[18]；經(jīng)證實(shí)，TNF-α是一多功能的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)包括細(xì)胞凋亡在內(nèi)的許多細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程，在抗腫瘤活動中發(fā)揮重要作用[19]；在防御和免疫系統(tǒng)中IFN-γ具有多種生物功能，如抗病毒、抗菌、抗增殖和抗腫瘤活性[20]；VEGF表達(dá)與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、腫瘤分化程度密切相關(guān)，可激活 Jak-Stat 通路里的 Stat-3[21]。ELISA法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PSSC組小鼠血清和腹水中的IL-2、IFN-γ和TNF-α水平增加，VEGF水平降低，均呈劑量依賴性。說明PSSC具有強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，其機(jī)制可能除了對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用外，還通過促進(jìn)宿主的免疫反應(yīng)而間接發(fā)揮作用。

Jak/Stat 蛋白被認(rèn)為是關(guān)鍵的細(xì)胞生長、增殖、分化和免疫調(diào)節(jié)功能。文獻(xiàn)報(bào)道[22]，STAT3經(jīng)JAK磷酸化，成為其活性形式-pSTAT3(Tyr705)，并形成二聚體從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與Bcl-2 啟動子結(jié)合，能減少 Bax 促凋亡基因的表達(dá)，而誘導(dǎo) Bcl-2 抗凋亡的基因的表達(dá)[23]。TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，PSSC呈劑量依賴性增加H22細(xì)胞凋亡數(shù)量，提示PSSC抗腫瘤作用可能與促H22細(xì)胞凋亡有關(guān)；Caspase-3和Caspase-8是細(xì)胞凋亡的重要介質(zhì)[24]，Caspase比色法發(fā)現(xiàn)，PSSC誘導(dǎo)H22細(xì)胞Caspase-3和Caspase-8活化，且隨著PSSC濃度的增加而表達(dá)上升。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，PSSC組Jak1、Stat3和Bcl-2蛋白隨著PSSC濃度的增加而表達(dá)降低，Bax/Bcl-2比值上升。推測PSSC的抗癌機(jī)制可能通過刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞生長，促進(jìn)分泌TNF-α、IFN-γ和 IL-2，減少 VEGF 表達(dá)，起到抗腫瘤作用。除此之外，還可能與通過激活 Caspase 家族和下調(diào)Jak1-Stat3表達(dá)，從而提高 Bax/Bcl-2 的比例，促進(jìn)H22細(xì)胞凋亡有關(guān)。

4 結(jié)論

PSSC對體外和H22荷瘤小鼠腹水模型具有一定的抗腫瘤作用，其機(jī)制可能與免疫調(diào)節(jié)與抗凋亡作用有關(guān)。可將PSSC作為一種新的免疫調(diào)節(jié)劑，為腫瘤藥物的開發(fā)提供一個(gè)新的依據(jù)和治療靶點(diǎn)。