光皮木瓜薄層鑒別方法改進研究

謝俊飛，朱田密，唐 甜，段雪云，陳樹和

(1.湖北省中醫院/湖北中醫藥大學附屬醫院 藥事部，湖北 武漢 430061；2.湖北中醫藥大學 藥學院，湖北 武漢 430065)

光皮木瓜是薔薇科植物木瓜(榠楂)Chaenomelessinensis(Thouin)Koehne的成熟果實，是藥食兩用植物，主產湖北、陜西、山東、安徽、江蘇等地[1-2]。因其干燥后果皮不皺縮，因而被稱為“光皮木瓜”[3]，或簡稱為“光木瓜”。光皮木瓜具有和胃舒筋、祛風除濕、消痰止咳的功效，用于吐瀉轉筋、風濕痹痛、咳嗽痰多、泄瀉、痢疾、腳氣水腫等[1]，主要化學成分含有機酸類、甾類、三萜類、木脂素類、黃酮類等，具有抗腫瘤、免疫調節、抗菌等多種生物活性，臨床應用較廣[4-5]。外皮皺縮的中藥材木瓜是光皮木瓜的常見易混淆品，二者的植物基源為同屬近緣種，功效有相似之處，但為兩種不同的中藥。中藥材木瓜收載于《中國藥典》，光皮木瓜則被地方中藥材標準收載[1，6]。《湖北省中藥材質量標準》2018年版收載的光皮木瓜質量標準中以光皮木瓜對照藥材為對照，采用硅膠色譜鑒別光皮木瓜中的特征成分黃酮類，但薄層色譜不夠清晰，分離度不足。因此，本研究對光皮木瓜的薄層鑒別方法進行改進，提高鑒別方法的準確性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ES225SM-DR電子天平(瑞士普利賽斯公司)；AS 220.R2型電子天平(波蘭RADWAG公司)；KQ-500VDE型雙頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-6恒溫水浴鍋(金壇市易晨儀器制造有限公司)；UPT-II-10 T優普系列超純水器(成都超純科技有限公司)；FW-80高速萬能粉碎機(上海科恒實業發展有限公司)；ZY-600U薄層色譜自動成像分析系統(北京先驅威鋒技術開發公司)。

1.2 試藥

槲皮苷對照品(批號111538-202007)，蘆丁對照品(批號100080-201409)，綠原酸對照品(批號110753-202018)，熊果酸對照品(批號110742-201823)，木瓜對照藥材(121003-201206)，均購自中國食品藥品檢定研究院；光皮木瓜對照藥材(自制)，光皮木瓜藥材，木瓜藥材(見表1)由湖北省中醫院朱田密副主任藥師鑒定為正品，標本留存于湖北省中醫院中藥研究所；聚酰胺薄膜10 cm×10 cm，由浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠提供；薄層層析硅膠G和硅膠G預制板由青島海洋化工廠提供；甲醇、甲酸、乙醚、乙醇、乙酸乙酯、冰醋酸、環己烷、丙酮、三氯甲烷等試劑均為分析純，水為純水。

表1 樣品信息

2 方法與結果2.1 槲皮苷、蘆丁、綠原酸的薄層色譜鑒別

取本品粉末1 g，加乙醚25 mL，加熱回流1 h，濾過，棄去乙醚液，藥渣揮盡乙醚，加乙醇25 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液[1]。另取光皮木瓜對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取槲皮苷對照品、蘆丁對照品、綠原酸對照品，分別加甲醇制成每1 mL含有0.03 mg的槲皮苷溶液和蘆丁溶液，以及每1 mL含有0.1 mg的綠原酸溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2020年版四部通則0502)試驗，吸取上述五種溶液各0.2 μL，分別點于同一聚酰胺薄層板上，以甲醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結果：供試品色譜中，在與綠原酸對照品色譜相應的位置上，顯相同的藍白色熒光斑點。再噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結果：供試品色譜中，在與光皮木瓜對照藥材色譜相應的位置上，以及槲皮苷、蘆丁對照品色譜相應位置上，顯相同的黃色熒光斑點。色譜斑點清晰，分離度好，見圖1。

注：1.槲皮苷；2.蘆丁；3.光皮木瓜樣品1；4.樣品2；5.樣品3；6.樣品4；7.樣品5；8.樣品6；9.樣品7；10.光皮木瓜對照藥材；11.綠原酸；12.樣品8(木瓜)。另外，本研究木瓜供試品溶液的制備方法與光皮木瓜相同。圖1 光皮木瓜中槲皮苷、蘆丁與綠原酸的薄層色譜

2.2 熊果酸的薄層色譜鑒別

取本品粉末1 g，加三氯甲烷10 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇-三氯甲烷(1∶3)混合溶液2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取光皮木瓜對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取熊果酸對照品，加甲醇制成每1 mL含有0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2020年版四部通則0502)試驗，吸取上述溶液各1～2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(6∶0.5∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光和紫外光燈(365 nm)下檢視[6]。結果：供試品色譜中，在與光皮木瓜對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點和熒光斑點；在與熊果酸對照品色譜相應的位置上，顯相同的紫紅色斑點和橙黃色熒光斑點，色譜清晰，斑點明顯，鑒別效果較好，見圖2。

注：1.熊果酸；2.光皮木瓜樣品1；3.樣品2；4.樣品3；5.樣品4；6.樣品5；7.樣品6；8.樣品7；9.光皮木瓜對照藥材；10.木瓜對照藥材；11.樣品8(木瓜)。另外，本研究木瓜對照藥材溶液及供試品溶液的制備方法與光皮木瓜相同。圖2 光皮木瓜中熊果酸的薄層色譜

3 討論

3.1 供試品制備方法考察

本研究針對光皮木瓜中黃酮類物質的提取，考察了兩種供試品制備方法：方法一即光皮木瓜質量標準原方法，采用乙醚脫脂之后，用乙醇回流提取；方法二采用甲醇超聲提取，濾過，濾液蒸干后，殘渣加水溶解，再用乙酸乙酯萃取。結果都提取出較多黃酮類物質，但方法一提取出的黃酮苷類略多，故維持原提取方法不變。

3.2 色譜條件的考察

在改進色譜條件過程中，對硅膠色譜試驗了多種展開劑：乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(5∶1∶0.5∶0.7)、乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1.5∶0.5)、乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)、三氯甲烷-冰醋酸-甲醇-丁酮(4∶3∶2∶3)、正丁醇-冰乙酸-水(3∶1∶1)、乙酸乙酯-正己烷-甲酸(5∶7∶0.8)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)等，都沒有達到理想的分離效果。由于聚酰胺對酚類、黃酮類化合物分離具有優勢[7]。故改用聚酰胺薄膜色譜，考察數種展開劑之后，發現菟絲子的薄層分離條件甲醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)能使光皮木瓜中黃酮類斑點達到較好的分離度[6]。值得注意的是，聚酰胺薄膜載樣量小，對黃酮類靈敏度高，點樣量不可過大，否則斑點向前擴展，導致Rf值偏大。

3.3 對照品的選用

根據光皮木瓜及近緣種所含化學成分的現有研究報道[8-10]，本研究考察了多種對照品，包括蘆丁、綠原酸、熊果酸、齊墩果酸、牡荊素、異牡荊素、兒茶素、金絲桃苷、槲皮素、槲皮苷。結果，供試品色譜中難以觀察到與牡荊素、異牡荊素、兒茶素、金絲桃苷對照品色譜中相應的斑點，進而采用高效液相色譜比對色譜峰，結果顯示光皮木瓜中不含有牡荊素、異牡荊素；雖然含有金絲桃苷，但薄層色譜中難以分辨，故不采用。齊墩果酸與熊果酸互為同分異構體，只是一個角甲基的位置不同[11]，在薄層色譜上Rf值極為接近，故效仿《中國藥典》木瓜項下只采用熊果酸作為對照品。實驗過程中制備的綠原酸對照品溶液放置8 h再次使用時出現了斑點擴散或兩個斑點的現象，表明綠原酸對照品溶液不穩定，需臨用前配制。

3.4 光皮木瓜與木瓜的薄層色譜對比

由薄層色譜圖可知，不同產地7批光皮木瓜成分基本一致，僅部分色譜斑點強弱有區別。實驗中還采用了同屬易混品木瓜作對比(圖1、圖2)，可以看到，光皮木瓜與木瓜的薄層色譜具有明顯區別，木瓜中的黃酮類色譜斑點數量和含量遠少于光皮木瓜，木瓜中的三萜酸類色譜斑點的強度大于光皮木瓜，故應用該薄層鑒別方法可區分二者。

4 結論

改進后的光皮木瓜薄層鑒別方法提高了黃酮類色譜斑點的分離度，新增槲皮苷、蘆丁、綠原酸、熊果酸四種對照品鑒別，提高了光皮木瓜薄層鑒別的準確性(光皮木瓜質量標準原方法[1]的薄層鑒別色譜見圖3)。本研究為光皮木瓜的定性鑒別提供了有效方法，可作為光皮木瓜對照藥材標定標準中的薄層鑒別方法。

注：1.光皮木瓜樣品1；2.樣品2；3.樣品3；4.光皮木瓜對照藥材。圖3 改進前的光皮木瓜薄層色譜(365 nm)