醋乳香揮發油GC指紋圖譜研究

段雨晴，黃 菊，孫婉瑾，陳樹和*，謝四芳，唐佩莉，段雪云

(1.湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430065；2.湖北省中醫院/湖北中醫藥大學附屬醫院/湖北省中醫藥研究院，湖北 武漢 430061)

乳香為橄欖科植物乳香樹BoswelliacarteriiBirdw.及同屬植物Boswelliabhaw-dajianaBirdw.樹皮滲出的樹脂，始載于《明醫別錄》，性溫，味苦、辛，歸肝、脾、心經。乳香有活血行氣止痛、消腫生肌之效，主治胸痹心痛、胃脘疼痛、痛經經閉、產后瘀阻等癥[1-2]。乳香含3%～8%的揮發油，其化學成分是以烯、醇和酮形式存在的多種單萜、倍半萜及二萜[3]，現代藥理研究表明，乳香揮發油有一定鎮靜、抗炎[4]、抗菌[5]等藥理作用，但其對黏膜有很強的刺激性，會引發嘔吐等不良癥狀，故臨床多用炮制除去部分揮發油以達到減毒增效的作用[6]。2020版《中國藥典》收載乳香的炮制方法為醋炙法，其醋炒的目的是增強活血止痛、收斂生肌的功效，并可矯臭矯味[7]，但現行規定中醋乳香的質量標準還不完善，不同產地和不同加工方式處理的醋乳香飲片質量存在一定的差異。中藥指紋圖譜技術能全面反映中藥材及其飲片的內在化學特征，適用于評價不同產區藥材中各化學組分的差異[8]，可作為中藥質量控制的手段之一。目前乳香指紋圖譜的研究主要集中在以生品和醋炙品中非揮發性成分建立HPLC指紋圖譜[7-9]，而對醋乳香揮發性成分的氣相色譜指紋圖譜的研究還處于空白階段，故本研究采用水蒸氣蒸餾法提取10批醋乳香中的揮發油，建立醋乳香揮發油氣相色譜指紋圖譜，旨在為醋乳香飲片質量控制提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 飲片樣品 本實驗用的10批醋乳香飲片經湖北省中醫院陳樹和主任藥師鑒定為正品，樣品批號和產地信息見表1。

表1 10批醋乳香飲片產地及來源信息

1.1.2 試藥 乙酸辛酯對照品(批號：111671-201704，純度≥98%，中國食品藥品檢定研究院)；1-辛醇對照品(批號：B24577，純度≥98%，中國食品藥品檢定研究院)；月桂酸對照品(批號：111774-201602，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；檸檬烯對照品(批號：100470-201503，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；無水硫酸鈉、無水乙醇、甲醇(均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 儀器

PerKElmer Clarus 580氣相色譜儀 (美國 PerKElmer公司)；PE-WAX ETR毛細管柱(0.25 μm× 0.25 mm，30 m)；SPH-300 氮氣發生器(北京中惠普分析技術研所)；CA-2型靜音無油空氣泵(武漢科林普豐儀器有限公司)。中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統 (2012A科研類，國家藥典委員會)。

2 方法與結果

2.1 氣相色譜條件

進樣口溫度：200 ℃，檢測器溫度：280 ℃，檢測器：FID，H2：45 mL/min，空氣：450 mL/min，分流比：20∶1，柱流量：1 mL/min，進樣量：1 μL。程序升溫：初始溫度50 ℃保持1 min，以25 ℃/min升到180 ℃保持3 min，以10 ℃/min 升到240 ℃保持5 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液制備 取10個批次醋乳香飲片粗粉(過二號篩)50 g，精密稱定，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加水約250 mL及沸石數粒，按照2020版《中國藥典》四部通則2204 揮發油測定法甲法測定揮發油含量，結果見表2。所得的揮發油用無水硫酸鈉除去水分后，置于-18 ℃冰箱內保存。分別精密移取揮發油0.2 mL，置于2 mL量瓶中，加入無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

表2 各批次醋乳香揮發油得率

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取檸檬烯對照品15.88 mg、乙酸辛酯對照品24.82 mg、1-辛醇對照品25.34 mg、月桂酸對照品11.28 mg，分別置于10 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成含檸檬烯1.588 mg/mL、乙酸辛酯2.482 mg/mL、1-辛醇2.534 mg/mL、月桂酸1.128 mg/mL的單一對照品儲備液。精密量取單一對照品儲備液各2.0 mL，置同一10 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，經 0.45 μm微孔濾膜濾過，得到含檸檬烯317.6 μg/mL、乙酸辛酯496.4 μg/mL、1-辛醇506.8 μg/mL、月桂酸225.6 μg/mL的混合對照品溶液，作為對照品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取S1號樣品供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，以乙酸辛酯為參照峰，測得各共有峰相對保留時間RSD均<1%，相對峰面積RSD均<5%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取S1號樣品平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，以乙酸辛酯為參照峰，測得各共有峰相對保留時間RSD均<3%，相對峰面積的RSD均<5%，表明所用方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取S1號樣品供試品溶液，按“2.1”項下氣相色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，以乙酸辛酯為參照峰，測得各共有峰相對保留時間RSD<3%，相對峰面積的RSD均<5%，說明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4 GC指紋圖譜的建立與分析

2.4.1 樣品的測定 取10批醋乳香飲片，按 “2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項條件下測定，記錄色譜圖。

2.4.2 共有峰的標定 將“2.4.1”項下測定的色譜圖依次導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012A版科研類)，因S6號樣品峰面積較大，分離度較好，故以 S6樣品圖譜作為參照譜進行全峰匹配，選取“時間窗”寬度為0.1 min，采用多點矯正法生成醋乳香揮發油GC共有圖譜和醋乳香揮發油GC疊加圖 (圖1)。綜合考慮各色譜峰共有狀況、分離情況和色譜峰面積，最后標記了20個色譜峰作為共有峰。計算各樣品共有峰峰面積的占比，結果顯示，各批樣品共有峰面積占比均為94%以上，符合指紋圖譜技術要求。

2.4.3 色譜峰的歸屬 采用對照品對各峰進行指認，在 “2.1”項條件下測定，記錄GC色譜圖，通過比較各峰保留時間，對色譜峰進行指認，結果顯示1號峰為檸檬烯，3號峰為乙酸辛酯，5號峰為1-辛醇，13號峰為月桂酸，見圖1。

2.4.4 相對峰面積和相對保留時間的計算 在各批次樣品氣相色譜圖中，3號色譜峰(乙酸辛酯)為各樣品所共有，峰信號強，與相鄰峰分離較好，并且乙酸辛酯為乳香揮發油的主要特征成分和有效成分，故以3號色譜峰作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，見表3、表4。結果表明，各共有峰相對保留時間RSD值均<3%，說明各共有峰出峰時間均較穩定，其中成分種類相對穩定，但各共有峰相對峰面積RSD值差異較大，說明各批次樣品各成分含量有較大不同。

表3 10批樣品GC圖譜共有峰的相對保留時間

表4 10批樣品GC圖譜共有峰的相對峰面積

2.4.5 相似度分析 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統對各批次醋乳香揮發油氣相圖譜進行相似度計算，見表5。結果顯示，各批醋乳香揮發油氣相色譜圖譜相似度均高于0.96，表明相似度良好。

表5 10批樣品相似度計算結果

2.4.6 聚類分析 將10批醋乳香樣品20個共有峰峰面積導入SPSS 23.0軟件進行聚類分析(圖2)。選用組內聯接聚類法，以歐式平方距離為度量標準；橫坐標值越小，表示樣品越相似。由圖2可知，10批樣品可分為2類，產地為蘇丹的醋乳香S9聚為一類，其余樣品聚為一類。

注：1.檸檬烯；3.乙酸辛酯；5.1-辛醇；13.月桂酸。圖1 各成分色譜圖

圖2 10批樣品的聚類分析樹狀圖

3 討論

在色譜條件優化時，以出峰數目、分離度、峰形狀為參考指標，結合參考文獻[10-13]嘗試多種不同程序升溫的方式，最終以本研究中程序升溫色譜條件為最優。在考察供試品制備所用溶劑時，在相同的制樣條件下比較正己烷、無水乙醇作為溶劑時所測得氣相色譜圖，結果發現以無水乙醇作為溶劑時，分離出的峰情況較好，故選擇無水乙醇為溶劑。

在采購不同批次樣品時，發現9號來自蘇丹的醋乳香樣品顏色為灰黑色，較其他炮制品顏色深，所提取揮發油為黃色，與其他批次醋乳香所提取的揮發油為淺黃綠色相比，顏色稍有不同，且提取揮發油后剩余的乳香殘渣質地較黏，附著在瓶壁上較難清洗，其乙酸辛酯峰與其他供試品相比，峰面積較小，聚類分析圖也證明與其他樣品不同，S9號樣品揮發油顏色和色譜峰的差異可能是產地差異或者炮制工藝不同造成。

本研究建立了10批醋乳香揮發性成分的氣相色譜指紋圖譜，各批飲片的峰數目和峰面積雖然存在一定差異，但整體特征相似，確定了20個共有峰，可反映醋乳香整體化學特征，相似度均>0.96，本研究可為醋乳香飲片質量控制提供參考。