基于網(wǎng)絡藥理學研究苦參治療COVID-19的作用機制

葉先文，張金蓮，鄧亞羚，劉敏敏，劉 穎，夏瀾婷，任洪民，李安全，葉嘉麗

(江西中醫(yī)藥大學藥學院，江西 南昌 330004)

冠狀病毒 (CoVs) 由單股正鏈RNA病毒構成，屬于冠狀病毒科，具有外套膜，感染的動物和人有可能發(fā)展為呼吸道、腸道和神經(jīng)系統(tǒng)等疾病[1]。2019年爆發(fā)的新型冠狀病毒由國際病毒分類委員會分類為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)，世界衛(wèi)生組織把這種病毒造成的疾病命名為COVID-19[2]。

COVID-19與嚴重急性呼吸綜合征 (SARS) 的病理機制類似，SARS-COV-2感染細支氣管上皮誘導細支氣管炎，侵入鄰近深部肺間質，造成肺泡壁上皮細胞的損傷，進而導致間質和肺泡水腫、出血，同時肺泡內形成透明膜[3]。石正麗團隊報道了SARS-CoV-2與一種蝙蝠中的CoVs序列一致性高達96%，推測其宿主來源于蝙蝠[4]。肖永紅團隊依據(jù)深度學習算法模擬得出SARS-CoV-2與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒 (SARS-CoV)、蝙蝠SARS-CoV和中東呼吸綜合征冠狀病毒 (MERS-CoV) 具有相近的感染力，并推測出蝙蝠和水貂可能是SARS-CoV-2的源頭[5]。穿山甲CoVs的S蛋白與SARS-CoV-2兩者的受體結合域僅存在一個氨基酸差異，這說明穿山甲也可能是SARS-CoV-2的起源或中間宿主[6]。鐘南山團隊在文獻報道中表明，63.4%的COVID-19患者的臨床癥狀是發(fā)燒，胸腔CT掃描出現(xiàn)肺異常，實驗研究表明COVID-19患者有淋巴細胞減少癥，反應蛋白 (CRP) 水平增加[7]。

苦參是豆科植物苦參SophoraeflavescentisAit的干燥根，氣微，味極苦[8]。苦參堿類生物堿具有抗乙型肝炎病毒 (HBV) 的作用[9]，能誘導HepG 2.2.15細胞凋亡，將細胞增殖阻滯于S期[10]。對乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)，乙型肝炎病毒s抗原 (HBsAg)的分泌也有抑制作用，高濃度的苦參堿能長期高效抑制HepG2.2.15細胞中HBV復制，該作用與病毒核酸復制和基因表達的抑制有關[11]?？鄥A類生物堿除抗HBV外，還能抗流感病毒、呼吸道合胞體病毒、牛乳頭狀瘤病毒和巨細胞病毒等[12]。COVID-19以“濕”邪為主，其病機為濕、毒、瘀、虛，中醫(yī)辨證為濕邪偏盛，而苦參味苦，性寒，是常用的燥濕藥，可退熱泄降，蕩滌濕火等，這為苦參可能治療COVID-19提供中醫(yī)藥理論基礎[2]。

近期網(wǎng)絡藥理學大量運用于中藥及中藥處方抗SARS-CoV-2研究，如藿香正氣口服液[13]、達原飲[14]、清肺排毒湯[15]等，本文基于TCMSP數(shù)據(jù)庫，運用網(wǎng)絡藥理學探尋苦參抗SARS-CoV-2的可能機制。

1 方法

1.1 化學成分搜索 SymMap[16]通過內部分子機制和外部癥狀定位，將中醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學結合，集TCM-ID、TCMID、TCMSP數(shù)據(jù)庫于一體。它收錄499種草藥、19 595種成分、1 717種相應的中醫(yī)癥狀。以“苦參”為關鍵詞對其化學成分進行搜索。

1.2 活性成分篩選 基于TCMSP[17]數(shù)據(jù)庫，以符合口服生物利用度(OB)>30%、類藥性(DL)>0.18為標準篩選化學成分，得到相應的靶標蛋白，即為活性成分。

1.3 靶標網(wǎng)絡構建及分析 通過UniProt[18]將靶標蛋白轉為相應的基因名，String[19]構建靶標蛋白的相互作用網(wǎng)絡 (PPI網(wǎng)絡)，同時將核心靶點與COVID-19相關的靶點進行共表達分析，利用Cytoscape 3.7.2[20]軟件平臺構建化合物-靶點PPI網(wǎng)絡。

1.4 靶點GO功能及KEGG通路富集分析 將靶點上傳至Metascape[21]，物種限定為人，閾值P<0.05，進行GO生物功能富集分析，同時通過DAVID[22]進行KEGG信號通路富集分析。

1.5 成分-靶點分子對接 從PDB[23]下載SARS-CoV-2 3CL 水解酶 (3CLpro) 和Uniprot新冠肺炎專題“View SARS-CoV-2 Proteins and Receptors”下的9個人體靶蛋白，見表1，TMPRSS2無晶體結構，利用Swiss-Model進行同源建模，見圖1。將10個目標大分子通過Discovery Studio 2016 Client軟件對其進行加氫，刪除水分子，移除配體等操作。將目標成分及大分子上傳CB-Dock[24]進行分子對接，以結合能≤-5.0 kJ/mol為分子-靶點有相互作用的依據(jù)[13-15]。

表1 3CLPro與9個人體靶蛋白信息

圖1 TMPRSS2預測模型

2 結果

2.1 化學成分篩選 基于SymMap獲得苦參化學成分114種，以OB>30%、和DL>0.18進行篩選后得到45種。在TCMSP中，23種成分已通過PreDC (Predict Drug Combination) 預測靶標蛋白，即為活性成分，見表2。

表2 苦參活性成分信息

2.2 化合物-靶點網(wǎng)絡分析 將TCMSP獲取的靶標蛋白以Uniprot進行標準化，利用Cytoscape 3.7.2構建化合物-靶點PPI網(wǎng)絡，見圖2，含223個節(jié)點、3 907條邊，其中23個節(jié)點為活性成分，剩余200個為相互作用靶點；平均度值Degree為35.04，倒三角形為成分，圓形為靶點，度值小于平均度值的底色為白色，度值越大越接近紅色，形狀也越大，以度值大于2倍Degree獲取核心網(wǎng)絡；成分K23 (Degree 145.0)、K13 (Degree 56.0)、K8 (Degree 36.0)可能為主要藥效物質；靶點AKT1 (Degree 128.0)、IL6和TP53 (Degree 117.0)、PTGS2 (Degree 111.0) 等28個靶點均大于2倍的平均度值，可能為苦參主要作用的靶標蛋白，見圖2，再對其進行共表達分析，見圖3，在該共表達網(wǎng)絡圖中，含34個節(jié)點、388條邊，平均度值22.8，其中27個節(jié)點為預測靶點 (除PTGS2)，剩余7個 (除MPP5、SGTA) 為與COVID-19相關的靶蛋白，提示核心靶點與新冠肺炎的發(fā)生發(fā)展具有緊密的相關性。

圖2 苦參成分-靶點PPI網(wǎng)絡

圖3 核心靶點與新冠肺炎相關靶點共表達分析

2.3 GO、KEGG信號通路富集分析 由Metascape獲得GO功能1 999項，其靶點按屬性可聚類成7項 (圖4A)，最顯著的一項以靶點淀粉樣β前體蛋白 (APP) 為中心，具有重要的突觸功能，充當細胞表面受體，并在神經(jīng)元表面執(zhí)行與神經(jīng)突生長，神經(jīng)元粘附和軸突發(fā)生有關的生理功能[25]，將前20項保留，見圖4B，推測細胞對有機環(huán)化合物的反應、對有毒物質的反應、細胞因子介導的信號傳導途徑等可能是苦參抗SARS-CoV-2重要生物過程。由DAVID富集到132條結果，其中92條對應多種疾病，如乙型肝炎、膀胱癌、前列腺癌等；通路有40條，較顯著的前3條為TNF信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路，大多與免疫和炎癥通路有關，提示苦參可能通過炎癥和免疫途徑抗SARS-CoV-2，見圖5。

2.4 分子對接 選擇表2中的生物堿 (苦參堿、槐果堿、槐定堿)及度值前三的化合物 (槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素)，與表1中的靶蛋白進行分子對接，結果見圖6～7。由此可知，目標成分與10個目標大分子的結合能均小于-5.0 kJ/mol，提示這些成分可能具有抗SARS-CoV-2的作用。

圖4 苦參作用靶點GO富集分析

圖5 苦參作用靶點KEGG信號通路富集(前20條通路)

圖6 苦參活性成分與目標蛋白的結合能熱圖

圖7 苦參堿與MPP5的分子對接模式

3 討論

氣溶膠傳播、糞-口傳播有可能是SARS-CoV-2的傳播途徑。Vincent Munster團隊報道了SARS-CoV-2和SARS-CoV在物體表面和氣溶膠中有相似的穩(wěn)定性和半衰期，表明SARS-CoV-2存在氣溶膠和其他途徑傳播[26]，有效的消毒對于減少SARS-CoV-2的氣溶膠傳播至關重要[27]。中山大學第五醫(yī)院在53.42%的COVID-19患者糞便中檢測出病毒RNA呈陽性，在胃腸道組織中也可檢測病毒RNA呈陽性，提示糞-口傳播可能為SARS-CoV-2的傳播途徑[28]。

吳玉章團隊在咽拭子樣本和尿液中發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2的N蛋白的結果與核酸檢測100%匹配，在73.6%的被診斷為COVID-19的患者尿液中檢測到病毒N蛋白，這表明N蛋白可能作為COVID-19的診斷方法[29]。高水平的利鈉肽患者死亡風險較大[30]，COVID-19患者可能發(fā)展為心肌炎和心力衰竭等嚴重心臟并發(fā)癥[31]。ACE2為SARS-COV-2入侵人體的主要受體蛋白，是抑制病毒與細胞結合、減少肺部和心臟損傷、抑制炎癥風暴的潛在治療靶點[32]。3CLpro作為冠狀病毒的主要蛋白酶之一，具有高度保守性，在SARS-CoV-2的復制過程中起重要作用，可在藥物設計中作為關鍵靶標[33]。NIH團隊研究表明，ACE2主要在精原細胞、睪丸間質細胞、以及支持細胞中表達，暗示睪丸可能也是SARS-CoV-2感染人體的靶點之一[34]。通過ePlant[35]對其進行定位表達分析，發(fā)現(xiàn)ACE2在腎臟中高表達，在心臟、肺部、支氣管等也有表達，提示在COVID-19治療中，應進行多個器官觀察，見圖8。在COVID-19老年及重癥患者中，T細胞、CD4+和CD8+T細胞總數(shù)顯著減少，T細胞數(shù)與血清炎癥因子濃度呈負相關，而在恢復期這些因子卻下降，且T細胞計數(shù)逐漸恢復。不僅如此，T細胞的耗竭標志物PD-1和Tim-3表達增高，進一步提示T細胞功能耗竭和減少為COVID-19患者的重要臨床特征[36]。在感染SARS-CoV-2后，CD4+T細胞轉變?yōu)橹虏⌒缘腡h1細胞，并產(chǎn)生GM-CSF等。細胞因子誘導單核細胞 (CD14+，CD16+) 的IL-6的高表達，過多的炎癥反應可能進入肺循環(huán)，破壞了免疫環(huán)境，從而導致肺功能損傷和快速死亡[37]。

苦參堿類生物堿雙向調節(jié)機體免疫功能，即高劑量免疫抑制，低劑量免疫促進[38]。在CoVs肺炎寒濕疫毒襲肺病證結合小鼠模型中，苦參堿氯化鈉注射液對模型組小鼠肺指數(shù)抑制率高達86.86%，其機制與抑制病毒復制、調節(jié)免疫功能 (升高外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞及B細胞的百分比) 和抑制炎癥因子 (IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ) 釋放有關[39]?？鄥A類生物堿有可能通過阻滯病毒吸附，減少病毒進入細胞并且抑制病毒在細胞內的復制，從而產(chǎn)生抗病毒作用；對磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號通路有上調作用，對把關受體-4/髓樣分化因子-88/TNF-α 受體相關信號通路有下調作用；通過上調或下調相關通路，不僅增加了干擾素的表達，還阻滯了炎性因子表達，減少病毒對細胞的損傷[12,40]。氧化苦參堿聯(lián)合恩替卡韋可抑制p38蛋白磷酸化，同時下調鈉離子-牛磺膽酸共轉運蛋白 (NTCP) 的表達，這可能是其抗病毒的機制[41]。

圖8 ACE2在人體呼吸循環(huán)系統(tǒng)中的表達

通過網(wǎng)絡藥理學方法，獲得苦參潛在活性成分23種，可能靶點200個，對其成分-靶點進行PPI網(wǎng)絡分析，發(fā)現(xiàn)苦參堿、槐果堿、槐定堿、槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素等可能是苦參抗SARS-CoV-2的關鍵成分，淀粉樣β前體蛋白 (APP)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 (AKT1)、白細胞介素6 (IL6)、細胞腫瘤抗原p53 (TP53)、前列腺素內過氧化物合酶2 (PTGS2) 等28個靶標度值大于2倍平均度值，且27個靶標與7個COVID-19相關靶點有緊密的共表達關系，提示這些核心靶點可能為苦參治療COVID-19的關鍵靶點。通過GO生物功能和KEGG信號通路富集分析，得到1 999個GO功能和132條KEGG信號通路。在GO功能中，多為細胞的應激反應，如細胞對有機環(huán)化合物、有毒物質、內毒素、激素、氧化等應激反應；也有生物調節(jié)功能，如正向調節(jié)細胞因子、胰島素及活性氧代謝等。在KEGG信號通路富集分析中，TNF信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、甲狀腺激素信號通路、p53信號通路、T細胞受體信號通路等40條通路可能為苦參抗SARS-CoV-2的途徑；乙型肝炎、膀胱癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、HTLV-Ⅰ 感染、小細胞肺癌等92條疾病途徑也可能與苦參抗SARS-CoV-2有關。在與COVID-19相關靶點的分子對接中，苦參堿、槐果堿、槐定堿、槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素與其結合能等均小于-5 kJ/mol，提示這些成分可能與新冠肺炎的相關靶點有良好的相互作用。

通過網(wǎng)絡藥理學方法系統(tǒng)的在多成分、多靶點、多途徑層面闡明苦參抗SARS-CoV-2的可能機制，后續(xù)將通過動物體內外試驗進一步探索苦參抗SARS-CoV-2的藥效作用及機制，為COVID-19的治療提供更多依據(jù)。