基于網絡藥理學和分子對接研究羅布麻抗抑郁機制

徐莉莉，李祥婷，張 雯,2，蔡定芳,2，王 飛，向 軍,2*

(1.復旦大學附屬中山醫院中西醫結合科，上海 200032；2.復旦大學中西醫結合研究院內科研究所，上海 200032；3.復旦大學附屬中山醫院藥劑科，上海 200032)

抑郁癥是以心情低落為主要癥狀的疾病，影響人體的認知、行為和社會功能。據統計全球約有3.5億抑郁癥患者，造成嚴重的社會和經濟負擔[1]。抑郁癥患病率和復發率均高，有預測到2030年抑郁癥可能成為我國負擔排名首位的疾病[2]。目前治療藥物主要基于經典的單胺類遞質學說，具有一定的局限性。因此，越來越多的研究者將目光投向天然藥物[3-4]。

羅布麻ApocynumvenetumL.屬夾竹桃科植物，以干燥葉入藥，味甘、苦，性涼，歸肝經，具有平抑肝陽、清熱利水等功效[5]。近年來，國內外學者在動物模型中發現羅布麻具有較好的抗抑郁作用[6-7]，但其活性成分、作用靶點等尚不明確，因此本研究擬通過網絡藥理學方法分析羅布麻的抗抑郁的潛在機制，為進一步研究提供參考。

1 方法

1.1 羅布麻成分收集和篩選 利用在線數據庫TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)、TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)結合文獻檢索收集羅布麻主要活性成分，并根據毒藥物動力學(ADME)參數對所得成分進一步篩選，包括藥物口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug likeness,DL)≥0.18。

1.2 羅布麻成分靶點預測 利用中藥成分靶點數據庫、靶點預測數據庫TCMSP、TCMID、文獻檢索進行驗證靶點和預測靶點的垂釣，進而獲取活性成分的作用靶點。

1.3 抑郁疾病靶點預測 采用疾病靶點數據庫GeneCard(http：//www.genecards.org/)、DisGeNET(https://www.disgenet.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(https：//omim.org/)，輸入關鍵詞“depression”，獲得抑郁的相關基因。

1.4 蛋白-蛋白相互作用網絡 利用Venny 2.1獲得成分與疾病的靶點的交集，導入String(http：//stringdb.org/)進行蛋白互作分析，結果保存為TSV格式文件，并將其導入Cytoscape 3.8.1(http：//www.cytoscape.org/)軟件進行網絡拓撲結構分析，構建蛋白-蛋白相互作用網絡。

1.5 成分-靶點-疾病網絡構建 利用“1.1”“1.2”“1.3”項下所得結果構建成分-靶點關系，Cytoscape 3.8.1(http://www.cytoscape.org/)軟件進行網絡拓撲結構分析，構建成分-靶點-疾病網絡。

1.6 靶點功能和通路富集分析 利用基因本體(gene ontology,GO)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)數據庫，以及R 3.6.3軟件運行的Bioconductor生物信息軟件包(http://www.bioconductor.org/)對靶點功能和通路進行富集分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

1.7 分子對接 PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載小分子數據，采用openbabel將其轉化為mol2格式，并用autodocktools程序提供的腳本prepare_ligand4.py為小分子添加電荷，分配原子類型，所有可旋轉鍵均設置為柔性，保存為pdbqt格式，用于分子對接。RCSB蛋白晶體數據庫下載受體蛋白數據，在pymol 1.7程序中刪除受體蛋白結構中的結晶水和其他小分子，添加氫原子后保存。載入AutoDocktool 1.5.6程序，添加電荷，分配原子類型，保存為pdbqt格式，作為分子對接受體，采用vina1.1.2軟件進行分子對接。對接盒子大小設置為能夠恰好包含蛋白的結合位點，選取對接最佳構象作為分子對接結果，提取結合能(affinity)評分并進行排序。結合力數值越低，表明結合越好。

2 結果

2.1 羅布麻活性成分及其靶點 數據庫中獲得56種羅布麻活性成分，經篩選后得到6種，包括山柰酚、右旋兒茶精、表兒茶素、花青素B1、木犀草素、谷甾醇，另外金絲桃苷、蕓香苷OB值雖然較低，但大量文獻報道兩者抗抑郁作用[8-11]，故也將其納入，最終獲得8種，見表1。利用數據庫查詢上述活性成分的靶點信息，篩選去重后得到118個作用靶點。

表1 羅布麻活性成分

2.2 羅布麻抗抑郁潛在靶點 共篩選出756個與抑郁相關的靶點，采用Venny 2.1軟件取其與羅布麻活性成分靶點的交集，最終得到34個共同靶點，見圖1。

圖1 羅布麻活性成分靶點與抑郁靶點交集Venny圖

2.3 成分-靶點-疾病網絡 網絡中共有113個節點及其相互聯系的184條邊，與疾病靶點作用最廣泛的成分是山柰酚、木犀草素、右旋兒茶精、蕓香苷，見圖2。

注：棕色三角形節點代表羅布麻活性成分，綠色長條形節點代疾病靶點，藍色長條形節點代表疾病。圖2 成分-靶點-疾病網絡

2.4 潛在靶點蛋白-蛋白互作網絡 如圖3A所示，網絡中共有33個節點及其相互聯系的277條邊。Degree值排名前20位的靶點見圖3B，可知INS、VEGFA、AKT1、TP53、IL-6、CAT、JUN、TNF等可能是抗抑郁的重要潛在靶點。

注：節點越大，顏色越深，表明該節點與其他節點之間的相互作用越廣泛密切。圖3 潛在靶點蛋白-蛋白互作網絡

2.5 GO分子功能富集分析 34個靶點通過GO富集分析，篩選出70個分子功能條目(P<0.05)，關系最密切的20條分子功能見圖4，包括細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)、受體配體活性(receptor ligand activity)、細胞因子活性(cytokine activity)、生長因子受體結合(growth factor receptor binding)、血紅素結合(heme binding)、四吡咯結合(tetrapyrrole binding)、氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)、磷酸酶結合(phosphatase binding)等。

圖4 GO功能富集分析氣泡圖

2.6 KEGG通路富集分析 34個靶點通過KEGG通路富集分析篩選出162條信號通路，關系最密切的20條信號通路見圖5，包括糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、C-型凝集素受體信號通路(C-type lectins receptor signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、胰島素抵抗(Endocrine resistance)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)等。

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.7 分子對接 將羅布麻4種主要活性成分與5個關鍵抗抑郁靶點蛋白采用Vina 1.1.2軟件進行分子對接，選取對接最佳構象作為分子對接結果，提取對接結合能(affinity)評分并進行排序，affinity值越低，表明結合越好。如表2所示，蕓香苷(rutin)與TP53、VEGFA、AKT1的結合評分最優，而木犀草素(luteolin)與IL-6、INS的結合評分最優，上述活性成分的與抗抑郁靶點的最佳復合結構見圖6。

3 討論

抑郁癥是一個涉及多種神經遞質、腦區及環路、多種機制的病理過程，包括單胺類遞質理論、GABA和其受體相互作用改變、神經生化機制、腦內谷氨酸濃度異常升高、腦內神經肽及受體改變、細胞因子水平改變、海馬神經元營養/再生學說、星形膠質細胞功能障礙、細胞信號機制異常等[12-14]。

表2 抗抑郁靶點分子對接評分

圖6 關鍵抗抑郁靶點與活性成分的最佳嵌合結構

為了探討羅布麻抗抑郁機制，本研究通過文獻和網絡數據庫篩選出羅布麻8個活性成分，包括山柰酚、兒茶素、表兒茶素、花青素B1、木犀草素、谷甾醇、金絲桃苷、蕓香苷，及其與抑郁相關的34個作用靶點。隨后通過整合這34個靶點構建蛋白相互作用網絡，發現INS、VEGFA、AKT1、TP53、IL-6、CAT、JUN、TNF等可能是羅布麻抗抑郁重要的潛在靶點。通過GO功能富集分析發現細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、生長因子受體結合、氧化還原酶活性、泛素蛋白連接酶結合、磷酸酶結合、蛋白磷酸酶結合等功能相密切相關。KEGG通路富集分析發現與糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路、C-型凝集素受體信號通路、IL-17信號通路、胰島素抵抗、Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路等密切相關。采用分子對接方法對關鍵抑郁靶點進行驗證，木犀草素、蕓香苷與關鍵抗抑郁靶點能夠最佳結合。

綜合抑郁癥的病理生理學研究進展以及羅布麻的網絡藥理學分析結果，推測羅布麻抗抑郁機制可歸納為神經炎癥、細胞凋亡兩個方面。其中神經炎癥主要涉及炎性因子靶點IL-6、VEGFA、IL-2、IL-10、TNF、NOS3、NOS2等及其介導的T細胞受體信號通路、IL-17信號通路；細胞凋亡靶點AKT1、TP53、JUN、STAT1、BCL2、MAPK1、MAPK8、BAX等及其介導的凋亡信號通路。由于神經炎癥與細胞凋亡之間的交叉重疊，且凋亡多為炎癥的下游反應，因此羅布麻抗抑郁作用可能與其調控炎性因子介導的神經炎癥與細胞凋亡有關。

炎性因子是參與炎癥反應的各類細胞因子的總稱，被認為是抑郁癥的發病機制中重要的環節之一[12]。1991年Smith首次提出抑郁癥與巨噬細胞過度分泌細胞因子有關[15]，隨后越來越多的抑郁癥患者被發現免疫系統基因調節異常、免疫功能失調[16-18]。深入研究發現炎性因子可影響神經遞質代謝、神經內分泌以及神經可塑性[12-14]，進一步證實炎性因子介導的病理過程與抑郁癥關系密切。根據效應的不同，炎性因子可分為促炎性因子和抗炎性因子。促炎性因子包括IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α等，在炎癥反應過程中加強炎癥反應并且誘導生成了更多的炎癥因子，協助人體完成免疫反應過程；抗炎性因子包括IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β等，抑制免疫系統過度的產生炎癥反應[16-18]。研究發現抑郁癥病理過程中IL-10、IL-1受體拮抗劑與IL-4、IL-13、TGF-β和脂聯素等抗炎性因子的表達是下降的，若補充外源抗炎性因子則具有一定的抗抑郁作用，同時藥物的抗抑郁作用也可能與其對抗炎性因子表達的上調有關[17-18]。因此，抗炎策略被認為在抑郁癥治療中有重要的應用前景。

已有研究發現羅布麻提取物或水煎劑在心血管系統、骨關節系統的抗炎作用以及對TNF-α、PGE2等炎癥因子的調節作用[19-20]。在中樞神經系統，羅布麻的主要活性成分也表現出較好的抗炎和神經保護作用。木犀草素可抑制脂多糖誘導的小膠質細胞活化及其釋放的多種促炎性因子如TNF-α、IL-1β、NO等[21]；蕓香苷可抑制三甲基錫誘導的小膠質細胞的活化及其釋放的促炎性因子，減輕海馬椎體細胞損傷[22]。因此，本研究推測羅布麻通過調控炎癥因子及其介導的神經炎癥是其抗抑郁的重要機制，后續研究中可借助細胞因子芯片等高通量檢測手段，篩選羅布麻相關的細胞因子表達譜，進一步明確其作用靶點和信號轉導通路。