三七丹參片調節高脂血癥小鼠脂質轉運的機制

吳志煥，曹丹丹，劉利敏

(1.河北工程技術學院，河北 石家莊 050091；2.河北醫科大學公衛學院，河北 石家莊 050017；3.惠州市中心人民醫院生殖醫學中心，廣東 惠州 516000)

高脂血癥是誘發心血管疾病的高危因素，尤其近來大型流行病學調查研究顯示低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)升高與動脈硬化性心血管疾病的發生密切相關[1]，2018美國心臟協會與2019年歐洲動脈粥樣硬化學會指南中均將控制LDL-C作為I級推薦證據。臨床上多采用化學藥物控制血脂，雖然具有較好的療效，但是會對肝臟和腎臟造成損害，長期服用依從性差。天然來源的藥物因其毒副作用較少而成為降脂研究領域的熱點[2-3]。三七丹參片主要成分包括三七和丹參，是治療心血管疾病中常用的中藥口服片劑，在預防心血管疾病具有良好價值[4]。既往研究多認為三七丹參片主要作用為活血化瘀，理氣止痛[5-6]，目前尚未有研究系統性闡述三七丹參片能否調節載脂蛋白及其生物學機制，本文從脂質轉運、吸收水平探討三七丹參片調節血脂的生物學機制。

1 材料與方法

1.1 動物 40只SPF級C57BL/6小鼠，雌雄各半，體質量18～20 g，由河北中醫學院提供，動物使用許可證號SYXK(冀)2017-005。

1.2 試劑與藥物 三七丹參片(湖南守護神制藥有限公司，批號20190117)。三磷酸腺苷結合盒轉運體(ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)兔單克隆抗體、ABCG1兔單克隆抗體，GAPDH鼠單克隆抗體均購自武漢三鷹生物技術有限公司；辣根過氧化物酶HRP標記的山羊抗兔IgG抗體購自生工生物工程(上海)股份有限公司；載脂蛋白A1(ApoA1)、ApoB均購自南京建成生物工程研究所；蛋白質裂解液購自美國Cell Signaling Technology公司；DNA反轉錄試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 儀器 CobasC501型全自動生化分析儀(瑞士羅氏公司)，QuantStudio 3型實時熒光定量PCR系統(美國賽默飛世爾公司)。

1.4 動物分組、造模與給藥 將C57BL/6小鼠隨機分為正常組、模型組及三七丹參片高、低劑量組，每組10只。正常組采用基礎飼料進行飼養；模型組和三七丹參片組喂養高脂飼料，飼料組成為基礎飼料52.2%、膽酸鈉0.2%、預飼料0.4%、碳酸氫鈣0.6%、膽固醇1.2%、豬油15%、蔗糖20%、酪蛋白10%、石粉0.4%。飼養期間可自由飲水，連續飼養6周后進行實驗。實驗開始后各組每日均給予普通飼料，自由飲水。給藥組均灌胃給予相應藥物，連續給藥1周；三七丹參片高劑量組給藥劑量為1.35 g/kg(約15倍臨床成人劑量)，低劑量組給藥劑量為0.45 g/kg(約5倍臨床成人劑量)。

1.5 取材 小鼠最后1次給藥后禁食12 h，可自由飲水。麻醉后眼眶取血，離心后取上清，于-80 ℃保存備用；取血完成后，開胸腔取出小鼠肝臟，擦干血跡后，一半采用4%甲醛固定進行檢測分析，另一半于-80 ℃保存備用。

1.6 血脂水平和肝酶活性的檢測 采用全自動生化分析儀對小鼠血清中血脂水平進行檢測，包括低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)；采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清中ApoA1及ApoB水平。

1.7 小鼠肝臟組織形態學評估 取各組小鼠石蠟包埋切片，制備HE染色后，顯微鏡下觀察病理學改變。

1.8 RT-qPCR檢測ABCA1、ABCG1 mRNA表達 取小鼠肝臟50 mg組織加入500 μL TRIzol后置于勻漿機低速離心90 s，離心完成后于冰上，加入350 μL氯仿混勻后于室溫下靜置15 min，隨后低溫12 000 r/min離心20 min，轉移上清液至EP管中，加入異丙醇500 μL再次低溫高速離心10 min，棄上清液后加入75%乙醇1 000 μL，低溫8 000 r/min離心5 min，重復2次后，室溫放至乙醇揮發凈后加入30 μL DEPC水，升溫至65 ℃溶解RNA，靜置5 min后取上清。取2 μL總RNA，加入RNA模板、primer、dNTP混合液、雙蒸水，20 μL反應體系下逆轉錄cDNA。使用LightCycler@480進行qPCR，ABCA1及ABCG1基因引物序列見表1，反應條件為95 ℃預變性15 s;隨后95 ℃ 5 s，58 ℃30 s變性；72 ℃延申15 s；重復42個循環；最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s溶解。以GAPDH為內參，以2-ΔΔCT法計算相對表達度，ΔΔCT=(CT實驗組目的基因-CT實驗組GAPDH)-(CT對照組目的基因-CT對照組GAPDH)。

表1 引物序列

1.9 Western blot檢測ABCA1、ABCG1蛋白表達 取50 mg小鼠肝臟，加入100 μL含有蛋白酶抑制劑的裂解液，勻漿機中低速勻漿1 min，隨后勻漿液置于冰上繼續裂解20 min，4 ℃下高速離心20 min，轉移上清液至EP管中備用。使用SDS-PAGE凝膠電泳，10%脫脂奶粉常溫封閉2 h后，加入兔抗ABCA1、ABCG1 (1∶1 000)和GAPDH(1∶4 000)置于冰箱中孵育24 h，室溫恢復后使用PBST洗滌3次，每次5 min，加入二抗 (1∶2 000) 室溫共孵育3 h，PBST洗滌，采用化學發光法顯影，結果用Quantity one軟件進行分析。

2 結果

2.1 三七丹參片對小鼠血脂水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清中LDL-C、TG、TC水平均升高(P<0.05)，HDL-C水平降低(P<0.05)；與模型組比較，三七丹參片各劑量組小鼠血清中LDL-C、TG、TC水平均降低(P<0.05)，HDL-C水平均升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠血脂水平

2.2 三七丹參片對小鼠載脂蛋白水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清中ApoB水平升高(P<0.05)，ApoA1水平降低(P<0.05)；與模型組比較，三七丹參片各劑量組小鼠血清中ApoB水平均降低(P<0.05)，ApoA1水平均升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組小鼠外周血載脂蛋白水平

2.3 三七丹參片對小鼠肝臟組織中ABCA1、ABCG1 mRNA表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝臟組織中ABCA1、ABCG1 mRNA表達降低(P<0.05)；與模型組比較，三七丹參片各劑量組小鼠肝臟組織中ABCA1、ABCG1 mRNA表達升高(P<0.05)，見表4。

表4 各組小鼠肝臟組織中ABCA1、ABCG1 mRNA表達

2.4 三七丹參片對小鼠肝臟組織中ABCA1、ABCG1蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠ABCA1、ABCG1蛋白表達均降低(P<0.05)；與模型組比較，三七丹參片各劑量組ABCA1、ABCG1 蛋白表達均升高(P<0.05)，見表5、圖1。

2.5 三七丹參片對小鼠肝臟組織病理形態的影響 正常組小鼠肝細胞結構完整，形態光滑，無脂肪堆積或侵蝕病變；模型組小鼠肝細胞堆疊不致密，包漿疏松化，可見空泡及炎癥性細胞侵蝕；三七丹參片組可一定程度減少小鼠肝臟組織脂肪病變，且高劑量組保護效果優于低劑量組，見圖2。

表5 各組小鼠肝臟組織中ABCA1、ABCG1蛋白表達

圖1 各組小鼠肝臟組織中ABCA1、ABCG1蛋白電泳圖

圖2 各組小鼠肝臟病理形態(HE，×100)

3 討論

高脂血癥典型特點為脂質轉運能力下降[7]，肝臟是體內脂質代謝的中樞，HDL-C負責將攝入脂質轉移至肝內代謝分解為膽汁酸排出體外，而LDL-C參與肝內TC轉運至肝外[8]。本研究顯示，模型組小鼠血清中LDL-C、HDL-C的異常改變，造成TG、TC水平升高；在三七丹參片干預后，小鼠血脂水平有所改善，且呈現一定劑量依賴性，提示三七丹參片能夠改善高脂血癥小鼠的血脂水平，且機制可能與脂質轉運、分布相關。

ApoA1作為HDL-C的載體蛋白，能夠結合游離膽固醇增加其水溶性，從而促進轉運至肝臟而代謝分解[9]，同時ApoA1能夠激活卵磷脂膽固醇酰基轉移酶(LCAT)的活性，正反饋調節促進TG運輸至肝臟[10]。本研究顯示，三七丹參片能夠一定程度逆轉高脂血癥小鼠ApoA1水平下降趨勢，結合血液HDL-C表達增加情況，推測三七丹參片降低TG、TC水平與調節ApoA1表達相關。同時三七丹參片組小鼠ApoB表達降低，而ApoB作為LDL-C的載體蛋白，能夠促使血管平滑肌細胞增生，從而加速膽固醇在細胞內的脂化過程，誘導沉淀，上調LDL-C水平[11]。

膽固醇逆向轉運初始限速步驟是游離膽固醇及磷脂與肝臟細胞內ApoA1結合[12]，而位于細胞膜上的ABCA1就是這一過程關鍵分子[13]，哺乳動物模型中ABCA1表達缺失或者功能障礙時，細胞內ApoA1因無法結合膽固醇而降解，從而導致血漿中HDL-C水平降低，膽固醇在血管壁沉積[14]。本研究中，模型組小鼠ABCA1 mRNA及蛋白表達均降低，這也解釋了血清中HDL-C水平下降的原因；而在三七丹參片組中，ABCA1表達增加，增加ApoA1與膽固醇結合，一方面抑制肝內ApoA1降解，另一方面達到降低血脂的效果。

ABCG1作為維持細胞內膽固醇和磷脂穩態的重要膜蛋白，促進HDL-2、HDL-3及HDL與載脂蛋白結合，同時與ABCA1協同作用，避免肝細胞內膽固醇過量堆積而造成肝損傷[15]。本研究小鼠肝臟組織形態學結果顯示，高脂血癥小鼠肝臟呈明顯脂肪樣病變，細胞漿氣球狀松化；而三七丹參片組小鼠肝臟病變程度較輕，這可能與ABCG1蛋白的保護功能相關，提示三七丹參片可能通過血脂轉運途徑，對肝臟細胞起到保護作用。