補腎活血方對腎虛血瘀型復發性流產小鼠胚胎植入及子宮免疫微環境的影響

韓永梅，衛愛武

(河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046)

復發性流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指連續發生至少2次妊娠不足20周胎兒丟失的病理現象，屬于育齡期女性常見病和疑難病[1]。研究顯示，胎盤植入的局部微環境異常改變是導致胎兒丟失的主要原因，胎盤植入過程與胚胎、子宮內膜等多因素相關，其中免疫微環境調節至關重要[2]。中醫學在治療復發性流產方面具有獨特優勢，現代中醫學通過聚類分析發現，腎虛血瘀是臨床復發性流產患者最為常見的證型，認為腎虛沖任不固為本，瘀血阻滯胞宮為標[3]。補腎活血方是根據復發性流產病機及辨證論治原則，該方由中醫經典補腎安胎方藥壽胎丸《醫學衷中參西錄》及養血活血安胎方藥芎歸湯《景岳全書·婦人規》配伍而成，具有補腎活血之功效[4]。為觀察補腎活血方對常規西藥對腎虛血瘀型復發性流產的輔助效果，本研究通過建立腎虛血瘀型復發性流產小鼠模型，分析其對胚胎種植及子宮免疫微環境的影響及機制，為臨床復發性流產的治療提供依據。

1 材料

1.1 動物 SPF級雌性CBA/J小鼠72只，雄性DBA/2小鼠30只，BALB/c小鼠6只，均為8周齡，體質量18～22 g，購自北京科宇動物養殖中心，動物生產許可證號SCXK(京)2018-0010。

1.2 藥物 菟絲子12 g，川續斷、桑寄生、阿膠、川芎各6 g，當歸9 g，藥材均購自上海市同仁堂藥業股份有限公司。除阿膠外，其余藥材加水浸泡30 min，武火煎煮30 min，取藥液200 mL過濾，再次加水文火煎煮30 min，取藥液200 mL過濾；兩次藥液合并煎煮，阿膠烊化混入藥液，制成含生藥1 g/mL濃煎液，4 ℃保存備用。地屈孕酮片(荷蘭Abbott Biologicals B.V.公司，國藥準字H20170221，規格10 mg)。

1.3 試劑 小鼠γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(批號C12592、C3021，美國Cygnus公司)；大鼠抗小鼠CD4+、CD8+單抗(批號PAB16751、PAB16420，美國AbD Serotec公司)；逆轉錄試劑盒(批號RR047 A，日本TaKaRa公司)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)試劑盒(批號WE0129-DBI，北京百奧萊博科技有限公司)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量分析試劑盒(批號QPBCA-1KT，美國Thermo公司)；大鼠抗小鼠腫瘤壞死因子受體I型(tumor necrosis factor receptor type I，TNFR1)、Fas相關死亡域蛋白(Fas-related death domain protein，FADD)、B淋巴細胞瘤-2基因(B lymphocyte tumor-2 gene，Bcl-2)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-8(containing aspartate proteolytic enzyme-8，caspase8)一抗(批號ab231925、ab119059、ab218123、ab25901，英國Abcam公司)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記IgG二抗(批號23-72101，武漢艾迪抗生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 分組和模型制備 72只雌性CBA/J小鼠按照體質量隨機分組法分為正常組、模型組、西藥組、高劑量組、低劑量組和聯合組，每組12只。除正常組外，其余各組制備腎虛血瘀型復發性流產小鼠模型[5]，灌胃0.2 mL羥基脲，同時皮下注射12 μL腎上腺素，連續1周；正常組小鼠灌胃0.2 mL超純水，皮下注射12 μL生理鹽水，連續1周。1周后正常組雌鼠與BALB/C雄鼠按2∶1比例合籠飼養，其余各組雌鼠與DBA/2雄鼠按2∶1比例合籠飼養1～2 d，合籠次日清晨檢出陰栓或陰道分泌物將其涂片見精子則記為孕1 d。

2.2 給藥方法 按照人與小鼠間的等效劑量換算[6]，小鼠灌胃地屈孕酮臨床等效劑量為3.6 g/kg，補腎活血湯劑量臨床等效劑量為100 g/kg。自孕1 d開始，西藥組灌胃36 μg/10 g地屈孕酮片水溶劑，高、低劑量組灌胃200、100 g/kg補腎活血湯，聯合組同時灌胃200 g/kg補腎活血湯和3.6 g/kg地屈孕酮片水溶劑，正常組和模型組灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續14 d。

2.3 胚胎丟失率計算 孕15 d后處死各組小鼠，剖腹取子宮組織，統計丟失胚胎數和正常胚胎數，正常胚胎呈大小均一的串珠狀，胚胎中間見紅色條索狀胎盤，丟失胚胎呈黑色或紫褐色，大小不均一，部分胚胎萎縮。計算胚胎丟失率為丟失胚胎數占總胚胎數的比例。

2.4 組織取材 冰上縱向剖開子宮組織，剝離胚胎后，取部分子宮組織，稱定質量后剪碎，按照1∶9比例加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，立即勻漿，4 ℃預冷離心機，12 000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)，取勻漿上清液，于-80 ℃保存備用。取部分子宮組織，置于40%中性甲醛中固定48 h備用。剝離蛻膜組織，于-80 ℃保存備用。

2.5 子宮組織病理學 取40%中性甲醛中固定的子宮組織，常規石蠟包埋，制作厚度為4 μm的連續切片，每只小鼠取5張切片，切片經脫蠟，酒精水化后進行常規蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，封片劑封片，光學顯微鏡下觀察并拍攝圖片。

2.6 子宮組織中CD4+、CD8+T淋巴細胞檢測 每只小鼠取5張切片，脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育7 min，PBS洗滌，96 ℃孵育10 min，滴加山羊血清，室溫孵育30 min，滴加大鼠抗小鼠CD4+、CD8+單抗(PBS代替一抗為陰性對照)，4 ℃過夜，滴加生物素標記兔抗大鼠IgG單抗，37 ℃孵育25 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加辣根或氧化物酶標記親和素，37 ℃孵育25 min，PBS洗滌3次，每次5 min，二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，流水終止。脫水、透明后中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并拍攝圖片，棕色或棕褐色染色為陽性細胞，每張切片取5個隨機視野，計數CD4+、CD8+T淋巴細胞數，取平均值。

2.7 子宮組織中IFN-γ、IL-4水平檢測 取子宮組織勻漿上清液，采用ELISA法[7]檢測IFN-γ、IL-4水平，按照試劑盒說明書操作，檢測570 nm波長處吸光度值，根據吸光度-濃度標準曲線計算待測樣本水平。

2.8 蛻膜組織中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8 mRNA檢測 取蛻膜組織，Trizol法[8]提取總RNA，酶標儀檢測260 nm和280 nm波長處吸光度(absorbance，A)值，A260/A280在1.6～1.8之間為合格，計算RNA純度。將RNA逆轉錄獲得互補鏈cDNA，SYBR Green熒光定量試劑盒進行RT-qPCR，25 μL反應體系為SYBR Premix Ex Taq 13.5 μL，10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL；反應條件為95 ℃預變性90 s；95 ℃變性20 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，重復40個循環；采用2-△△CT法[9]計算目的基因相對內參β肌動蛋白(β-actin)表達量，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.9 蛻膜組織中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8蛋白表達檢測 取蛻膜組織，于液氮中研磨后轉至離心管，加入0.5 mL細胞裂解液于冰上裂解25 min，沸水水浴10 min變性，12 000 r/min離心15 min(離心半徑10 cm)，取上清進行BCA蛋白總量檢測。取40 μg蛋白與等量Loading buffer混勻，進行SDS-PAGE，電壓80 V至指示劑進入分離膠，120 V電泳至結束，電轉儀將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，封閉液室溫封閉2 h，Tris鹽酸吐溫緩沖液(Tris-Hcl tween hydrochloride buffer，TBST)洗滌3次，每次10 min，加入一抗TNFR1(1∶200)，FADD(1∶300)，Bcl-2(1∶300)，caspase8(1∶500)，4 ℃過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，加入相應的稀釋二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，加入電化學發光法顯影、定影，凝膠成像系統掃描拍照，Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值，目的蛋白與內參β-actin灰度值的比值表示蛋白相對表達量。

3 結果

3.1 補腎活血方對小鼠胚胎丟失率的影響 正常組、西藥組、高劑量組和聯合組均造模成功(妊娠10只)，模型組和低劑量組造模成功9只。如表2所示，與正常組比較，模型組小鼠胚胎丟失率升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組胚胎丟失率均降低(P<0.05)，并且聯合組<西藥組<高劑量組<低劑量組。

表2 各組胚胎丟失率比較

3.2 補腎活血方對小鼠子宮組織病理學改變的影響 如圖1所示，正常組小鼠子宮組織細胞無明顯異常，細胞核深染清晰；模型組小鼠子宮組織細胞核染色較淺，呈現邊聚、碎裂情況；各給藥組細胞核邊聚和碎裂現象減少，結構清晰，其中聯合組改善最為明顯。

注：黑色箭頭指示細胞核碎裂，綠色箭頭指示細胞核邊聚。圖1 各組小鼠子宮組織病理學(HE，×400)

3.3 補腎活血方對小鼠子宮組織免疫微環境的影響 如表3、圖2～3所示，與正常組比較，模型組小鼠子宮組織IFN-γ、CD4+、IFN-γ/IL-4、CD4+/CD8+水平均升高(P<0.05)，IL-4、CD8+水平均降低(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組小鼠子宮組織IFN-γ、CD4+、IFN-γ/IL-4、CD4+/CD8+水平均降低(P<0.05)，并且聯合組<西藥組和高劑量組<低劑量組；與模型組比較，各給藥組小鼠子宮組織IL-4、CD8+水平均升高(P<0.05)，并且聯合組>西藥組和高劑量組>低劑量組；西藥組和高劑量組比較，小鼠子宮組織IFN-γ、IL-4、CD4+、CD8+、IFN-γ/IL-4、CD4+/CD8+水平無明顯變化(P>0.05)。

表3 各組小鼠子宮組織中IFN-γ/IL-4、CD4+/CD8+水平

注：黑色箭頭指示CD4+T淋巴細胞。圖2 各組小鼠子宮組織CD4+免疫組化染色圖(×400)

注：黑色箭頭指示CD8+T淋巴細胞。圖3 各組小鼠子宮組織CD8+免疫組化染色圖(×400)

3.4 補腎活血方對小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8 mRNA表達的影響 如表4所示，與正常組比較，模型組小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、caspase8 mRNA表達升高(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表達降低(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、caspase8 mRNA表達均降低(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表達升高(P<0.05)，其中聯合組TNFR1、FADD、caspase8 mRNA表達最低，且Bcl-2 mRNA表達最高。

表4 各組小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8 mRNA表達

3.5 補腎活血方對小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8蛋白表達的影響 如圖4～5所示，與正常組比較，模型組小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、caspase8蛋白表達升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、caspase8蛋白表達均降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05)，其中聯合組小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、caspase8蛋白表達最低，且Bcl-2蛋白表達最高(P<0.05)。

圖4 各組小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8蛋白條帶圖

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與西藥組比較，$P<0.05；與高劑量組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05。圖5 各組小鼠蛻膜組織中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8蛋白表達柱狀圖

4 討論

復發性流產病因復雜，除遺傳、解剖、內分泌等臨床常見因素外，多數與免疫因素有關[10-11]。母體免疫系統對胚胎抗原的保護性免疫耐受，是維持妊娠序貫正常進行的前提條件，子宮免疫微環境異常改變可導致胚胎植入異常，最終導致流產發生[12]。臨床常用地屈孕酮、黃體酮等藥物治療，但療效仍不理想[13]。本研究結果顯示，補腎活血方輔助常規西藥可有效改善腎虛血瘀型復發性流產小鼠子宮免疫微環境，促進胚胎植入，其機制可能與調節TNFR1信號通路有關。

本研究發現，補腎活血方聯合西藥可有效降低胚胎丟失率、子宮組織IFN-γ/IL-4、CD4+/CD8+水平，提示補腎活血方輔助常規西藥可有效促進腎虛血瘀型復發性流產小鼠胚胎植入，增強母體對胚胎的免疫耐受程度?！吨T病源候論》提出本病為氣血兩虛、沖任不固、胎失榮養所致，其中腎虛血瘀是導致滑胎的關鍵因素，其后在多種中醫著作中均有提出[14-15]。補腎活血方以補腎安胎經典方壽胎丸為主，配伍“治一切胎氣不安”之養血活血安胎方芎歸湯為輔。補腎活血方中菟絲子補腎益精，固攝沖任，重用為君；桑寄生、續斷補益肝腎，養血安胎為臣；阿膠補血為佐；當歸養血活血，川芎理氣行滯為使，諸藥合用共奏補腎活血、益氣安胎之功效。馮曉玲等[16]臨床應用補腎活血方治療復發性流產發現，中醫癥狀明顯改善，為妊娠提供良好母體內環境。Th1細胞屬于攻擊性細胞，可分泌IFN-γ，誘導免疫排斥發生，IL-4由Th2細胞分泌，主要誘導免疫耐受[17]。CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群同樣是調節機體免疫耐受的細胞群之一，前者具有細胞毒性作用，后者具有負性調節作用[18]。補腎活血方中多種中草藥活性成分聯合地屈孕酮能夠更好的調節子宮免疫微環境，降低流產風險。此外，本研究發現，補腎活血方聯合西藥可下調蛻膜組織中TNFR1、FADD、caspase8 mRNA和蛋白表達，上調Bcl-2表達。TNFR1主要表達于蛻膜組織，FADD表達于滋養層，臨床研究顯示[19]，復發性流產患者TNFR1和FADD表達均異常升高，可導致血管內皮損傷，致使胚胎失養而流產。TNFR1與腫瘤壞死因子結合后，前者發生多聚化反應從而激活caspase8，啟動凋亡信號通路[20]。Bcl-2是TNFR1信號通路下游的抗凋亡因子，其表達量升高可修復受損線粒體從而抑制細胞凋亡[21]。本研究中補腎活血方可輔助地屈孕酮抑制TNFR1信號通路激活，從而改善胚胎植入局部環境穩定，促進胚胎植入。