化痰活血降氣方對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能和炎癥因子的影響

余 寧，周新燕，張 念，余 丹，楊 碩，葉樹鳴

(武漢市中西醫結合醫院，湖北 武漢 430022)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種常見的以氣流受限為特征的可以預防和治療的疾病，其氣流受限多呈進行性發展，與氣道和肺組織對煙草煙霧等有害氣體或有害顆粒的慢性炎性反應有關[1]，其發病以炎癥機制為核心，有多種因素的介入包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、內皮素1(endothelin 1，ET-1)等炎癥因子和轉錄激活因子4(STAT4)和STAT6，引起氣道、肺實質與肺血管的炎癥反應及結構重塑，導致肺組織的損傷[2-4]。

中醫藥在治療COPD方面具有獨特的優勢，本團隊前期實驗研究發現，慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者，以化痰活血降氣法治療，可以降低氣道局部和全身的炎癥相關細胞因子水平，減輕呼吸道局部和全身的炎癥反應水平，取得良好的臨床療效[5]，現通過觀察氣管內滴注LPS聯合煙熏COPD模型大鼠肺組織病理形態學、肺功能、肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、ET-1的水平和肺組織中STAT4、STAT6蛋白表達，進一步探討化痰活血降氣法治療慢性阻塞性肺疾病的作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性Wistar大鼠36只，體質量200～220 g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCKX(京)2016-0002。

1.2 藥物 化痰活血降氣方顆粒劑由丹參(批號 18080028)30 g、赤芍(批號18040038)10 g、桃仁(批號18060087)10 g、杏仁(批號 18060087)10 g、蘇子(批號18080061)10 g、款冬花(批號18020095)10 g、瓜蔞皮(批號18050010)10 g、浙貝母(批號 18040054)10 g、黃芩(批號18030117)10 g、魚腥草(批號 17100130)30 g、苦參(批號18020100)10 g、麻黃(批號17050111)10 g組成，四川新綠色藥業科技發展股份有限公司生產。醋酸潑尼松片(華中藥業股份有限公司，批號20180505)。

1.3 試劑 大鼠TNF-α、IL-1β、ET-1酶聯免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司(批號L-2880)；兔多克隆抗體GAPDH購自杭州賢至生物科技有限公司(貨號AB-P-R001)；兔多克隆抗體STAT4(貨號51070-2-AP)、兔多克隆抗體STAT6(貨號51073-1-AP)均購自武漢三鷹生物技術有限公司；黃鶴樓牌香煙購自甘肅煙草工業有限責任公司。

1.4 儀器 AniRes動物肺功能儀(北京貝蘭博科技有限公司)；ICV-450型電熱恒溫培養箱(日本ASONE公司)；FlexStation 3型多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)；電轉儀(北京六一儀器廠)；T8-1型磁力攪拌器(江蘇省金壇市中大儀器廠)。

2 方法

2.1 COPD模型制備 參照文獻[6]方法加以改良后，采用氣管內滴注LPS加煙熏法建立COPD大鼠模型，分別于第1、14天往大鼠氣管內滴注LPS(0.1 mg/100 g)，第2～13、15～28天，每天上午將大鼠放置在48 L玻璃密閉箱內，持續熏黃鶴樓牌香煙霧30 min，每只大鼠使用1支，每天1次。

2.2 分組及給藥 36只健康雄性Wistar大鼠按隨機數字表法分為空白組、模型組、陽性對照組及化痰活血降氣方高、中、低劑量組，每組6只。空白組大鼠不予任何處理，其余各組均建立COPD模型。化痰活血降氣方臨床常規用量160 g/d(按生藥計)，醋酸潑尼松片臨床常規用量50 mg/d，按照人與動物體表面積換算法計算[7]，造模成功后按28.8、14.4、7.2 g/kg生藥劑量分別給高、中、低劑量組大鼠灌胃化痰活血降氣方，陽性對照組給予灌胃醋酸潑尼松片劑量為4.5 mg/kg，正常組和模型組灌胃給予等容量蒸餾水，持續給藥28 d。

2.3 大鼠肺功能的檢測 灌胃給藥結束后用AniRes動物肺功能分析系統檢測大鼠的肺功能指標包括0.3 s用力呼氣容積(FEV0.3)、0.3 s用力呼氣容積與用力肺活量比值百分數(FEV0.3/FVC)、呼氣流量峰值(PEF)。

2.4 肺組織與病理形態學觀察 大鼠處死后，結扎未灌洗的左肺取肺組織，經脫水、透明、石蠟包埋，蠟塊4 μm切片后脫蠟水化，進行蘇木素-伊紅(HE)染色，透明后中性樹膠封片，100倍及200倍光鏡觀察。

2.5 ELISA法檢測大鼠肺泡灌洗液中細胞因子TNF-α、IL-1β、ET-1水平 收集大鼠肺泡灌洗液(BALF)，3 000 r/min離心10 min，取各組大鼠BALF上清液按照ELISA試劑盒說明操作，計算TNF-α、IL-1β、ET-1水平。

2.6 Western blot法檢測大鼠肺組織中STAT4、STAT6蛋白表達 將少量剪碎的組織置于2 mL EP管中，充分裂解30 min后，在4 ℃下12 000 r/min離心5 min，取上清液保存。采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，取蛋白樣本凝膠電泳、轉膜，用5%脫脂奶粉封閉,加入一抗GAPDH(1∶1 000)、STAT4(1∶1 000)、STAT6(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。洗滌5次，加入二抗(1∶50 000)37 ℃孵育2 h，TBST洗滌5次，ECL試劑顯色曝光,用BandScan分析灰度值。

2.7 免疫組化法檢測大鼠肺組織STAT4、STAT6蛋白表達 各組大鼠肺組織經脫水透明、浸蠟包埋、脫蠟、抗原修復后，添加3%過氧化氫室溫孵育15 min，洗滌3次后加血清室溫封閉30 min，甩干后加一抗(稀釋比例為1∶100)4 ℃孵育15 h，PBS沖洗3次后加酶標二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗4次滴加DAB顯色液，蘇木素復染后PBS浸洗返藍，脫水分片鏡檢，棕黃色或棕褐色為目標蛋白。觀察每張切片4個高倍視野(×400)，通過圖像分析軟件Image J軟件分析每個視野的平均光密度(MOD)值，取平均值，整理數據并統計分析。

3 結果

3.1 化痰活血降氣方對大鼠肺組織病理學的影響 空白組大鼠支氣管結構基本完整，肺血管壁未見明顯增厚，肺泡結構基本完整，少量散在的炎性細胞浸潤；模型組大鼠氣管上皮細胞脫落，杯狀細胞增生，管腔內可見分泌物，大量炎性細胞浸潤，肺血管壁增厚，肺泡間隔變窄并斷裂，融合成較大的囊腔；陽性對照組大鼠支氣管結構的破壞、炎性細胞的浸潤、肺泡間的融合均較前改善，但肺血管壁仍可見明顯增厚；化痰活血降氣方高劑量組大鼠支氣管上皮細胞的破壞較模型組減輕，血管壁增厚不明顯，炎性細胞的浸潤及肺泡融合擴張明顯減輕，與陽性對照組相當，中劑量組肺組織病理變化較模型組稍有減輕，低劑量組病理學變化接近模型組。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色圖(×100)

3.2 化痰活血降氣方對大鼠肺功能的影響 與空白組比較，模型組大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF水平均降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組及化痰活血降氣方各劑量組大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF水平均升高(P<0.01)，且呈劑量依賴性；與陽性對照組比較，化痰活血降氣方高劑量組FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF水平無無明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肺功能

3.3 化痰活血降氣方對大鼠BLAF中TNF-α、IL-1β、ET-1水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、ET-1水平均升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組及化痰活血降氣方低劑量組大鼠BLAF中TNF-α、IL-1β、ET-1水平均降低(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴性。各組間比較，以化痰活血降氣方高劑量組療效最優，其降低TNF-α、ET-1水平作用與陽性對照組相當。見表2。

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中細胞因子水平

3.4 化痰活血降氣方對大鼠肺組織中的STAT4、STAT6蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠肺組織中STAT4、STAT6表達均升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組及化痰活血降氣方各劑量組STAT4、STAT6表達均降低(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴性。各組間比較，以化痰活血降氣方高劑量組療效最優，與陽性對照組相當。見表3、圖2。

表3 各組大鼠肺組織中STAT4、STAT6蛋白表達(±s，n=6)

注：A為空白組，B為模型組，C為陽性對照組，D～F為化痰活血降氣方高、中、低劑量組。圖2 各組大鼠肺組織中STAT4、STAT6蛋白表達

3.5 化痰活血降氣方對大鼠肺組織中STAT4、STAT6表達的影響 免疫組化染色后STAT4、STAT6陽性表達在鏡下表現為棕黃色顆粒。與空白組比較，模型組大鼠肺組織中STAT4、STAT6表達均升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組及化痰活血降氣方各劑量組STAT4、STAT6表達均降低(P<0.01)，且呈劑量依賴性。見表4、圖3～4。

表4 各組大鼠肺組織中STAT4、STAT6表達

圖3 各組大鼠肺組織中STAT4表達(免疫組化，×400)

圖4 各組大鼠肺組織中STAT6表達(免疫組化，×400)

4 討論

COPD屬中醫“喘病”“肺脹”等病，中醫認為“痰”“瘀”是其關鍵病理因素，痰瘀阻肺，肺氣不降始終是本病的主要病機，化痰活血降氣方以赤芍、桃仁、丹參活血化瘀；杏仁、蘇子利肺降氣；炙麻黃宣肺平喘；款冬花降氣化痰；全瓜蔞、浙貝母、黃芩、魚腥草、苦參清熱化痰，該方化痰、活血、降氣三法并施，使本病盡快進入緩解期，促進正氣的恢復，改善體質，減少再次發作，在前期臨床觀察證實療效顯著，現通過大鼠實驗研究探討其作用機制。

COPD模型組大鼠肺組織病理切片可見氣道黏膜上皮細胞破壞，杯狀細胞增生，大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔變窄并斷裂，血管壁增厚，符合COPD的病理學特點，提示氣管內滴注LPS聯合煙熏法COPD建模成功。與模型組比較，化痰活血降氣方高劑量組炎性細胞的浸潤及肺泡融合擴張明顯減輕，中劑量組肺組織炎性改變也有所減輕，并且高劑量組的抗炎作用與醋酸潑尼松相當，佐證了化痰活血降氣方可以通過抗炎和減輕肺組織重構治療COPD。

肺功能檢查是診斷COPD的金標準[8]，FEV1和FEV1/FVC是提示氣流受限和COPD嚴重程度的敏感指標，PEF能夠反映氣道阻塞程度，因大鼠的呼吸頻率比人快，所以選用 FEV0.3/FVC來代替 FEV1/FVC[9]。本研究結果顯示，模型組大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF較空白組降低，客觀指標提示氣管內滴注LPS聯合煙熏法COPD建模成功，經化痰活血降氣方治療后都有不同程度的回升，其中以高劑量組的療效最優，與醋酸潑尼松療效相當，所以化痰活血降氣方可以改善肺功能，減輕氣道阻塞。

炎癥細胞參與了慢性阻塞性肺病的病理過程，釋放多種炎性介質，誘導損傷和修復的反復循環[10]。其中TNF-α是單核-巨噬細胞所形成的單核因子，是在細胞炎癥反應中起關鍵作用的巨噬細胞核轉錄因子κB(NF-κB)的有效激活劑[11]，并且能夠誘導中性粒細胞釋放蛋白水解酶破壞肺血管內皮和肺泡上皮[12]。IL-1β也是COPD的主要促炎因子，可促進中性粒細胞在氣道周圍募集，不斷加重炎癥反應，并且引起支氣管黏膜水腫，腺體分泌增多，加重氣道阻塞，使氣流受限進一步惡化[13-14]。ET-1是由內皮細胞分泌的內源性血管收縮劑[15]，有促進細胞增殖的作用，引起血管壁增厚及管狹窄，血管收縮和細胞增殖導致血管重塑[16]，同時ET-1參與NF-κB的激活及其他促炎細胞因子(包括TNF-α)的表達[17]。本研究結果顯示，模型組大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、ET-1炎癥因子較空白組均升高，經化痰活血降氣方治療后都有不同程度的降低，其中以高劑量組的療效最優，與醋酸潑尼松療效相當，所以化痰活血降氣方可通過降低肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、ET-1的水平來減輕肺組織的炎癥反應，并且ET-1水平降低可以減輕肺血管重塑，IL-1β水平的降低可以緩解支氣管粘膜水腫，減輕氣道阻塞，阻止COPD病情加重。

近年來相關研究表明Th1/Th2功能平衡在肺部疾病中起關鍵作用[18]，Th1細胞和Th2細胞可通過分泌相關的因子，引發機體的一系列促炎與抗炎反應。Th1細胞主要分泌INF-γ等炎癥因子，INF-γ激活中性粒細胞引起肺部炎癥反應，其轉錄因子STAT4蛋白能夠誘導Th0向Th1分化，并且具有促炎作用[19-20]。Th2細胞分泌IL-4等抑炎因子，可引起免疫細胞對機體產生保護，減輕肺部炎癥，并且能夠抑制Th1細胞增殖作用，其轉錄因子STAT6蛋白能誘導Th0向Th2的分化，具有免疫調節和抑炎作用[19-21]。本研究結果顯示，模型組大鼠STAT4蛋白表達升高，STAT6蛋白表達降低，經化瘀活血降氣方治療后，STAT4蛋白表達有不同程度降低，STAT6蛋白表達有不同程度的提升，均以化痰活血降方高劑量組為最優，其作用與醋酸潑尼松片相當。所以化痰活血降氣方可以通過抑制STAT4蛋白表達使Th0向Th1細胞分化減弱，減少INF-γ等促炎因子的分泌，減輕肺部炎癥反應；同時促進STAT6蛋白表達，加強Th0向Th2細胞分化，增加IL-4等抑炎因子的分泌，有助于Th1/Th2恢復平衡，達到治療慢性阻塞性肺疾病的作用。

綜上所述，化痰活血降氣方可通過降低BLAF中TNF-α、IL-1β、ET-1等炎癥因子水平，抑制STAT4蛋白表達，促進STAT6蛋白表達，從而有助于Th1/Th2恢復平衡，抑制氣道炎癥反應、修復肺泡間的融合、緩解血管壁增厚，改善COPD大鼠肺組織的炎癥反應，證實化痰活血降氣方確能有效抑制COPD的炎癥反應，阻止病情加重。