固腎養陰湯對反復自然流產小鼠母胎界面Th1/Th2平衡的調節作用

何丹娟，梁少榮，陳碧娟

(1.華中科技大學同濟醫學院附屬湖北婦幼保健院中西醫結合科，湖北 武漢 430000；2.華中科技大學同濟醫學院附屬湖北婦幼保健院生殖中心，湖北 武漢 430000)

反復自然流產是常見的人類生殖疾病，發病率呈上升趨勢，給女性身心健康造成嚴重影響[1]。反復自然流產發病機制復雜，母胎免疫耐受與母胎界面免疫微環境穩態關系密切，母胎免疫耐受機制在發病過程中起關鍵作用[2-3]，此外，輔助性T細胞Th1/Th2平衡在免疫微環境的調控中發揮重要作用，可能參與母胎免疫耐受[4]。因此，探討反復自然流產母胎界面免疫微環境的調節機制，并尋找有確切療效的藥物具有重要臨床意義。中醫藥在反復自然流產的臨床治療中有重要地位。反復自然流產屬“滑胎”范疇，中醫認為腎氣不固、腎精虧虛、氣血兩虛、陰血損耗是其主要病機[5-6]。固腎養陰湯是根據反復自然流產病機、臨床辨證論治原則，總結壽胎丸與安奠二天湯化裁而成，該方由菟絲子、續斷、桑寄生等中藥組成，具有固腎養陰安胎之功效。本研究旨在探討固腎養陰湯對反復自然流產模型小鼠母胎界面Th1/Th2平衡的調節作用，以期為其臨床應用提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 SPF級雌性CBA/J小鼠60只，雄性DBA/2小鼠24只，雄性BALB/c小鼠6只，均為7周齡，體質量18～22 g，購自華中科技大學動物實驗中心，實驗動物生產許可證號SCXK(鄂)2019-0009。

1.2 藥物 固腎養陰湯組方為菟絲子(批號2011002S)15 g，續斷(批號2009001S)、補骨脂(批號2005001S)、山茱萸(批號2009001C)、阿膠(批號1903005C)各10 g，桑寄生(批號1910001S)、黃芪(批號2006008C)各20 g，杜仲(批號1912002C)、生地黃(批號2007012C)各12 g，枸杞子(批號2006004S)、黃芩(批號2008004C)各9 g，上述藥物均購自合肥華潤三九醫藥有限公司，經湖北省婦幼保健院梅凌峰主管藥師鑒定為正品。所有中藥混合，水煎2次，合并藥液煎煮制成生藥量為1 g/mL的濃煎液，4 ℃保存備用。黃體酮膠囊(益瑪欣，國藥準字H20041902，規格50 mg，批號20200106)購自浙江仙琚制藥股份有限公司。

1.3 試劑 小鼠IFN-γ、IL-10 ELISA試劑盒(滁州仕諾達生物科技有限公司，貨號SND-M010、SND-M195)；實時熒光定量聚合酶聯反應試劑盒、逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司，貨號RR820A、RR037Q)；BCA蛋白定量分析試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號23225)；兔抗小鼠細胞因子信號傳遞抑制因子SOCS1、SOCS3一抗(英國Abcam公司，貨號ab280886、ab280884)；辣根過氧化物酶(HRP)標記IgG二抗(北京百奧萊博科技有限公司，貨號WK355-FOV)。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司設計和合成。

2 方法

2.1 分組與建模 參考文獻[7]方法，60只雌性CBA/J小鼠按照體質量排序法隨機分為正常組、模型組、黃體酮組、固腎養陰湯組、中西藥合用組，每組12只。正常組雌鼠與BALB/c雄鼠2∶1合籠，其余各組雌鼠與DBA/2雄鼠2∶1合籠，次日清晨檢出陰栓或陰道分泌物涂片見精子則建模成功，為孕0 d。正常組12只、模型組10只、黃體酮組10只、固腎養陰湯組11只、中西藥合用組11只建模成功入組。

2.2 給藥方法 根據臨床等效劑量換算[8]黃體酮給藥劑量為0.4 mg/kg，固腎養陰湯給藥劑量為28 g/kg。黃體酮組小鼠灌胃給予0.4 mg/kg黃體酮(蒸餾水稀釋)，固腎養陰湯組小鼠灌胃給予28 g/kg固腎養陰湯，中西藥合用組小鼠同時灌胃給予0.4 mg/kg黃體酮和28 g/kg固腎養陰湯，正常組、模型組灌胃給予等量蒸餾水，每天1次，孕0～15 d連續給藥。

2.3 流產情況及組織取材 孕15 d處死各組小鼠，剖腹取完整子宮組織，記錄吸收胚胎數和正常胚胎數，正常胚胎大小均一，肉眼可見紅色條索狀胎盤；吸收胚胎大小不均一，子宮呈黑色或紫褐色。計算胚胎吸收率，公式為胚胎吸收率=吸收胚胎數/總胚胎數×100%。取胎盤組織(含蛻膜組織)，部分置于40%中性甲醛中固定48 h備用；部分置于-80 ℃保存備用。

2.4 母胎界面組織病理形態觀察 取固定于40%中性甲醛中的胎盤組織，常規石蠟包埋，制作4 μm的連續切片，然后行常規蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察母胎界面組織病理形態改變情況。

2.5 ELISA法檢測白細胞介素10(IL-10)、γ干擾素(IFN-γ)水平 取-80 ℃保存子宮組織，稱定質量后剪碎，按照子宮組織與磷酸鹽緩沖液質量比1∶9加入磷酸鹽緩沖液，于冰上勻漿，預冷離心機12 000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，取勻漿上清液，采用ELISA法并根據試劑盒說明書操作，檢測IL-10、IFN-γ水平，于490 nm處檢測光密度值，計算待測樣本濃度。

2.6 母胎界面組織中SOCS1、SOCS3 mRNA表達檢測 取-80 ℃保存子宮組織，稱定質量后采用Trizol法[9]提取總RNA，酶標儀檢測總RNA純度，并經瓊脂糖凝膠電泳鑒定；反轉錄獲得互補鏈cDNA，以之為模板鏈進行實時熒光定量PCR反應，按照SYBR Premix Ex Taq II試劑盒說明書設定反應體系，反應條件為95 ℃預變性90 s；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，45個循環，72 ℃再延伸5 min；以GAPDH為內參對照，按照2-△△CT法[10]計算SOCS1、SOCS3表達。引物序列為SOCS1正向5′-ACACGTAGGTGCTAGTG-3′，反向5′-CCTAGCTGCTATG CTGA-3′；SOCS3正向5′-GCTGCTGATATGCTGAT-3′，反向5′-ATGCTGATGTCGTGATC-3′；GAPDH正向5′-GGATGCTG ATGTCGTAGCA-3′，反向5′-TAGCTGTAGCTGTAGTCGT-3′。

2.7 母胎界面組織中SOCS1、SOCS3蛋白表達檢測 取-80 ℃保存子宮組織，稱定質量后置于液氮中研磨，加入RIPA裂解液冰上孵育25 min，12 000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，取上清液測定蛋白總量。取50 μg待測蛋白與等量上樣緩沖液混勻，沸水水浴10 min變性，于80 V/120 V進行SDS-PAGE電泳分離，經濕轉法將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜上，加入脫脂奶粉封閉2 h，充分洗膜，加入1∶200 SOCS1，1∶400 SOCS3一抗，4 ℃搖床過夜；充分洗膜，加入1∶1 000稀釋二抗，37 ℃孵育1 h；充分洗膜，加入電化學發光液顯影，掃描拍照后，圖像分析軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參GAPDH灰度值比值代表蛋白表達。

3 結果

3.1 胚胎吸收率 正常組、模型組、黃體酮組、固腎養陰湯組、中西藥合用組胚胎吸收率分別為(5.50±1.24)%、(28.54±3.29)%、(21.26±3.57)%、(17.41±3.20)%、(12.85±2.72)%，與正常組比較，模型組小鼠胚胎吸收率升高(P<0.05)；與模型組比較，黃體酮組、固腎養陰湯組和中西藥合用組小鼠胚胎吸收率均降低，并且中西藥合用組<固腎養陰湯組<黃體酮組(P<0.05)。

3.2 各組小鼠母胎界面組織病理形態改變 正常組蛻膜細胞形態正常，排列整齊，血管豐富，絨毛形態正常；模型組小鼠蛻膜細胞變性，部分壞死，蛻膜細胞連接喪失，血管較少，絨毛形態不一，排列紊亂，多量炎性細胞浸潤；黃體酮組小鼠蛻膜組織中血管稍增多；固腎養陰湯組和中西藥合用組小鼠蛻膜組織、絨毛形態明顯改善，血管更為豐富，中西藥合用組改善最為明顯，見圖1。

圖1 各組小鼠母胎界面組織病理形態(HE，×100)

3.3 各組小鼠母胎界面勻漿上清液中IL-10、IFN-γ水平 與正常組比較，模型組小鼠母胎界面勻漿上清液中IFN-γ水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)；與模型組比較，黃體酮組、固腎養陰湯組和中西藥合用組小鼠母胎界面勻漿上清液IFN-γ水平均降低，IL-10、IL-10/IFN-γ水平升高，且各指標活性強度表現為中西藥合用組>固腎養陰湯組>黃體酮組(P<0.05)，見表1。

3.4 各組小鼠母胎界面組織中SOCS1、SOCS3 mRNA表達 與正常組比較，模型組小鼠母胎界面組織中SOCS1 mRNA表達升高，SOCS3 mRNA表達降低(P<0.05)；與模型組比較，黃體酮組、固腎養陰湯組和中西藥合用組小鼠母胎界面組織中SOCS1 mRNA表達均降低，SOCS3 mRNA表達均升高，且各指標活性強度表現為中西藥合用組>固腎養陰湯組>黃體酮組(P<0.05)，見表2。

表1 各組小鼠母胎界面勻漿上清液中IL-10、IFN-γ水平

表2 各組小鼠母胎界面組織中SOCS1、SOCS3 mRNA表達

3.5 各組小鼠母胎界面SOCS1、SOCS3蛋白表達 與正常組比較，模型組小鼠母胎界面組織中SOCS1蛋白表達升高，SOCS3蛋白表達降低(P<0.05)；與模型組比較，黃體酮組、固腎養陰湯組和中西藥合用組小鼠母胎界面組織中SOCS1蛋白表達均降低，SOCS3蛋白表達均升高，且各指標活性強度表現為中西藥合用組>固腎養陰湯組>黃體酮組(P<0.05)，見表3、圖2。

表3 各組小鼠母胎界面組織中SOCS1、SOCS3蛋白表達

圖2 小鼠母胎界面組織中SOCS1、SOCS3蛋白Western blot條帶圖

4 討論

反復自然流產由遺傳因素、環境因素等多種因素交互作用而致，但仍有50%左右原因不明[11-12]。臨床常用激素類藥物治療，但效果尚不理想[13]。母胎界面免疫微環境失調與反復自然流產關系密切，改善母胎界面免疫微環境誘導母胎免疫耐受，對提高妊娠成功率有重要意義[14]。

中醫藥歷史悠久，古今中醫藥典籍中有許多診治滑胎的方略，安胎療效確切[15-16]。固腎養陰湯由《醫學衷中參西錄》中的壽胎丸和《傅青主女科》中的安奠二天湯結合而來，方中含菟絲子、續斷等11味中藥，多味藥相互配合，達到固腎養陰、健母益胎的功效。

本研究中黃體酮、固腎養陰湯單獨及聯合給藥后，反復自然流產小鼠胚胎吸收率降低，母胎界面蛻膜組織病理改變有所改善，IFN-γ水平降低，IL-10水平、IL-10/IFN-γ比值升高，組織中SOCS1 mRNA和蛋白表達降低，SOCS3 mRNA和蛋白表達升高，且各指標活性強度表現為中西藥合用組>固腎養陰湯組>黃體酮組，說明黃體酮和固腎養陰湯均能改善母胎界面免疫微環境，抑制SOCS1，促進SOCS3轉錄和表達，且聯合用藥效果最好。研究發現，胎兒對于母體屬于非己抗原，母體識別抗原則產生免疫應答，母體通過調控免疫平衡產生免疫耐受則胎兒順利植入胎盤，否則易排斥胎兒造成流產[17]。Th1/Th2免疫平衡在母胎界面胚胎植入過程中發揮重要調控作用。Th1細胞及其細胞因子可從多方面影響胚胎植入，如IFN-γ可下調主要組織相容性復合體(MHC)表達而使胎盤受到機體免疫攻擊；IFN-γ的細胞毒作用可破壞胎盤結構，同時可促進黃體細胞凋亡導致孕酮水平降低[18-19]。Th2細胞及其細胞因子IL-10、IL-4可抑制機體免疫炎癥反應，具有Th1負性調節作用[20]。藥理學研究表明，滋陰藥對過亢免疫反應具有抑制作用，可調節機體免疫力[21]。菟絲子等藥物中含有類雌激素，利于促黃體生成素釋放激素的釋放及卵巢對其反應性[22]。Mesaki等[23]發現，SOCS家族分子具有負反饋調節作用，與機體免疫，尤其是與Th1/Th2免疫平衡關系密切。SOCS1具有抑制Th1細胞及其細胞因子的作用，但過度表達可抑制Th2細胞分化使Th1/Th2平衡向Th1偏移[24]。

綜上所述，固腎養陰湯有利于改善反復自然流產小鼠母胎界面免疫微環境，聯合西藥改善效果更佳，維持母胎界面Th1/Th2平衡的Th2型優勢，調控SOCS1、SOCS3表達，利于胎兒免疫耐受，改善妊娠結局，為臨床反復自然流產的防治提供理論基礎。