一測多評法測定新疆假龍膽中3種環(huán)烯醚萜苷

耿若愚，居博偉,3，楊建華，胡君萍*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

新疆假龍膽Gentianellaturkestanerum(Gand.) Holub是龍膽科1年或2年生草本植物，主要分布于新疆伊犁等地，該藥材具有利濕消腫、清熱解毒等功效，全草可入藥，民間用其全草泡茶治療感冒、發(fā)熱等癥，在保肝利膽、消腫祛濕方面積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)[1-3]。綜合文獻(xiàn)調(diào)研及課題組前期研究顯示，黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類成分是假龍膽主要成分，環(huán)烯醚萜苷類成分包括龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷等，具有保肝、抗炎等藥理作用，對肝纖維化、急性肝損傷、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的防治表現(xiàn)出巨大潛力[4-9]。新疆假龍膽作為新疆道地特色藥用資源，在保肝防治研究領(lǐng)域具有較大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，但到目前為止尚未見有新疆假龍膽藥材質(zhì)量控制方面的研究報(bào)道，且現(xiàn)有市售的3種環(huán)烯醚萜苷對照品價(jià)格高昂，獲取渠道單一，給藥材的質(zhì)控研究帶來一定困難，因而亟需一種低成本、高效便捷的活性成分檢測分析方法。一測多評法(quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS)是指在多成分可同時(shí)測定的條件下，只測定其中一個(gè)成分(價(jià)格低廉，或者易獲得)的含量，并計(jì)算其他成分與此成分的相對校正因子(relative correction factor，RCF)，從而快速測定多成分的含量[10-17]。本研究采用一測多評法測定新疆假龍膽中的環(huán)烯醚萜苷成分的含量，以龍膽苦苷為內(nèi)標(biāo)物，分別獲取龍膽苦苷與獐牙菜苦苷和獐牙菜苷的相對校正因子，最后得出3種成分的含量。此方法操作簡便、高效準(zhǔn)確，以期實(shí)現(xiàn)以單指標(biāo)對新疆假龍膽進(jìn)行多指標(biāo)成分質(zhì)量控制的目的，為新疆假龍膽藥材質(zhì)量控制體系的建立以及種屬資源鑒定提供了參考。

1 材料

1.1 儀器 島津LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司)；Waters e2696-2998高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；依利特Supersil ODS2(4.6 mm×250 mm，5 μm，柱號 E3121502)、Cosmosil Packed Column 5C18-MS-Ⅱ(4.6 mm×250 mm，5 μm，柱號 K62746)、Waters XBridge Sgield RP18(4.6 mm×250 mm，5 μm，柱號186003010)、Waters XBrigeTM C18(4.6 mm×250 mm，5 μm，柱號 186003117)、依利特Supersil AQ-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm，柱號 E3015357)、Thermo SCIENTIFIC ODS HYPERSIL(4.6 mm×250 mm，5 μm，柱號 10285071)、依利特 Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm，柱號 E25221344)，上述色譜柱依次命名為C1～C7；AB135-S型分析天平(瑞士Mettler yoledo公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FJY1002-UVF基因研究型超純水機(jī)(青島富勒姆科技有限公司)。

1.2 試劑與藥物 龍膽苦苷(批號SG8140)、獐牙菜苦苷(批號SS8760)、獐牙菜苷對照品(批號SS8750)，均購于北京索萊寶科技有限公司；甲醇(色譜級，美國Fisher公司)；磷酸(分析純，批號CB1282-77,石家莊化工廠生產(chǎn))；水為超純水；新疆假龍膽10批，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院胡君萍教授鑒定為新疆假龍膽Gentianellaturkestanerum(Gand.) Holub全草，具體信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 依利特 Supersil ODS2柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇(A)-0.03%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～30 min，20%A；30～45 min，20%～80%A；45～50 min，80%A；50～65 min，80%～20%A)；柱溫30 ℃；體積流量1.5 mL/min；檢測波長240 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取獐牙菜苷、龍膽苦苷、獐牙菜苦苷對照品適量，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容，得混合對照品溶液。獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷對照品質(zhì)量濃度分別為92.70、18.90、2.30 mg/L。

2.3 供試品溶液制備 稱取新疆假龍膽適量，粉碎，取新疆假龍膽粉末約0.1 g，精密稱定，置于10 mL量瓶中，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，補(bǔ)充甲醇減少的量，搖勻，濾過，為新疆假龍膽樣品貯備液。取1 mL樣品貯備液于10 mL量瓶中，用初始比例流動(dòng)相稀釋定容，即為供試品溶液。使用前用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。在上述色譜條件下，獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷的分離度良好，均大于1.5，理論塔板數(shù)大于3 000，色譜圖見圖1。

1.獐牙菜苦苷 2.龍膽苦苷 3.獐牙菜苷1.swertiamarin 2.gentiopicrosideuse 3.sweroside圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別吸取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液2、6、12、16、20 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄峰面積，每個(gè)濃度測量3次，取平均值。以待測對照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，各環(huán)烯醚萜苷的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得回歸方程，結(jié)果表明3種環(huán)烯醚萜苷在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表2。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄3種環(huán)烯醚萜苷的色譜峰面積，計(jì)算相應(yīng)的RSD。得獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷峰面積RSD分別為0.8%、1.9%、3.3%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批次供試品溶液10 μL，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄3種環(huán)烯醚萜苷的色譜峰面積，計(jì)算相應(yīng)的RSD。得獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷峰面積RSD分別為0.51%、2.10%、2.19%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的新疆假龍膽粉末約0.1 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，精密吸取供試品溶液各10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄各個(gè)環(huán)烯醚萜苷的色譜峰面積，計(jì)算相應(yīng)的RSD。得獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷峰面積RSD分別為0.44%、0.32%、2.05%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批次新疆假龍膽藥材粉末0.25 g，分別精密加入混合對照品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各環(huán)烯醚萜苷的平均加樣回收率和RSD。結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.3 Results of recovery tests for various constituents(n=6)

2.5 相對校正因子計(jì)算

2.5.1 多點(diǎn)校正法計(jì)算相對校正因子 在一定的線性范圍內(nèi)，以內(nèi)參物(s)與其他待測成分(i)的相對校正因子的計(jì)算公式為

(1)

其中，RCF代表相對校正因子、s代表內(nèi)參物、i代表其他待測成分、A表示色譜峰面積、C代表相應(yīng)的對照品濃度。

分別吸取混合對照品溶液6、10、12、16、20 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄3種環(huán)烯醚萜苷的色譜峰面積，以龍膽苦苷(A)為內(nèi)參物，按式(1)計(jì)算獐牙菜苦苷(B)和獐牙菜苷(C)的相對校正因子，并計(jì)算RSD。計(jì)算得到獐牙菜苦苷和獐牙菜苷相對于龍膽苦苷的相對校正因子分別為1.399、0.499，RSD分別為0.407%、3.979%，結(jié)果見表4。

表4 各成分相對校正因子Tab.4 Relative correction factors of various constituents

2.6 相對校正因子的耐用性考察

2.6.1 色譜柱對校正因子的影響 分別使用5只不同型號的色譜柱，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL。記錄3種環(huán)烯醚萜苷的色譜峰面積，按公式(1)計(jì)算以龍膽苦苷為內(nèi)參物的相對校正因子的平均值分別為1.399、0.485，相應(yīng)的RSD分別為0.887、0.342，表明得到的相對校正因子在不同儀器和色譜柱之間的耐用性良好，結(jié)果見表5。

2.6.2 儀器對校正因子的影響 分別使用3臺(tái)不同型號的儀器，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL。記錄3種環(huán)烯醚萜苷的色譜峰面積，按式(1)計(jì)算以龍膽苦苷為內(nèi)參物的相對校正因子的平均值分別為1.486、0.517，相應(yīng)的RSD分別為4.979%、3.589%，表明得到的相對校正因子在不同儀器和色譜柱之間的耐用性良好，結(jié)果見表6。

表5 不同色譜柱對相對校正因子的影響Tab.5 Effects of different columns on relative correction factors

表6 不同HPLC儀器對相對校正因子的影響Tab.6 Effects of different HPLC instruments on relative correction factors

2.6.3 不同體積流量對相對校正因子的影響 精密吸取同一混合對照品溶液10 μL分別以體積流量為1.3、1.4、1.5、1.6、1.7 mL/min條件下進(jìn)樣，記錄3種環(huán)烯醚萜苷的色譜峰面積，計(jì)算相應(yīng)的相對校正因子分別為1.402、0.519，相應(yīng)的RSD分別為0.846%、1.298%，表明相對校正因子在1.3～1.7 mL/min的體積流量范圍內(nèi)耐用性良好，結(jié)果見表7。

2.6.4 不同檢測波長對相對校正因子的影響 精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，分別在檢測波長為238、239、240、241、242 nm的條件下進(jìn)樣，記錄3種環(huán)烯醚萜苷的色譜峰面積，計(jì)算相應(yīng)的相對校正因子分別為1.418、0.488，相應(yīng)的RSD分別為3.597%、1.590%，表明相對校正因子在檢測波長為238～242 nm范圍內(nèi)耐用性良好，結(jié)果見表8。

表7 不同體積流量對相對校正因子的影響Tab.7 Effects of different flowing rates on relative correction factors

表8 不同檢測波長對相對校正因子的影響Tab.8 Effects of different detection wavelengths on relative correction factors

2.7 相對保留時(shí)間法預(yù)測待測成分色譜峰的定位 待測色譜峰的定位可以通過計(jì)算相對保留時(shí)間，相對保留時(shí)間是指待測組分與內(nèi)參物保留時(shí)間的比值，計(jì)算公式為

ras=tRa/tRs

(2)

2.7.1 不同儀器、色譜柱對相對保留值的影響 分別使用3臺(tái)不同型號的儀器以及不同型號的色譜柱，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL。記錄3種環(huán)烯醚萜苷的保留時(shí)間，按式(2)計(jì)算以龍膽苦苷為內(nèi)參物的相對保留值的平均值分別為1.309、0.819，相應(yīng)的RSD分別為0.339%、0.750%，表明得到的相對保留值在不同儀器和色譜柱之間的重復(fù)性良好，結(jié)果見表9。

表9 不同儀器、色譜柱下的相對保留值Tab.9 Relative retention under different instruments and chromatographic columns

2.7.2 不同體積流量對相對保留值的影響 精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，分別在體積流量為1.3、1.4、1.5、1.6、1.7 mL/min條件下進(jìn)樣，記錄3種環(huán)烯醚萜苷的保留時(shí)間，計(jì)算相應(yīng)的相對保留值分別為1.331、0.814，相應(yīng)的RSD分別為1.795%、0.277%，表明得到的相對保留值在體積流量1.3～1.7 mL/min范圍內(nèi)重復(fù)性良好，結(jié)果見表10。

表10 不同體積流量下的相對保留值Tab.10 Relative retention at different flowing rates

2.7.3 不同柱溫對相對保留值的影響 精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，分別在柱溫為25、30、35、40 ℃的條件下進(jìn)樣，記錄3種環(huán)烯醚萜苷的保留時(shí)間，計(jì)算相應(yīng)的相對保留值分別為1.306、0.818，相應(yīng)的RSD分別為3.800%、2.021%，表明相對保留值在柱溫為25～40 ℃范圍內(nèi)重復(fù)性良好，結(jié)果見表11。

表11 不同柱溫下的相對保留值Tab.11 Relative retention at different column temperatures

2.7.4 不同進(jìn)樣量對相對保留值的影響 分別吸取混合對照品溶液2、6、12、16、20 μL進(jìn)樣，記錄記錄3種環(huán)烯醚萜苷的保留時(shí)間，計(jì)算相應(yīng)的相對保留值分別為1.317、0.821，相應(yīng)的RSD分別為0.422%、1.631%，表明相對保留值在進(jìn)樣量為2～20 μL范圍內(nèi)重復(fù)性良好，結(jié)果見表12。

表12 不同進(jìn)樣量下的相對保留值Tab.12 Relative retention under different injection volumes

2.8 雙標(biāo)線性校正法預(yù)測待測色譜峰定位 相對保留時(shí)間法是目前常用的色譜峰定性方法，但由于色譜柱和色譜儀的差異，其預(yù)測結(jié)果與實(shí)際結(jié)果存在較大差異，并且需要限定色譜柱和色譜儀才能使用，在實(shí)際工作中應(yīng)用性不強(qiáng)，準(zhǔn)確性不能得到保障。王龍星等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在不同的色譜柱上組分的保留時(shí)間存在線性關(guān)系。在此基礎(chǔ)上孫磊等[18]提出了雙標(biāo)線性校正技術(shù)，即在兼顧效率和成分的同時(shí)，能夠較為準(zhǔn)確的定性色譜峰。雙標(biāo)線性校正技術(shù)主要有3個(gè)步驟，首先在待測組分中選擇雙標(biāo)成分，在未知色譜柱上運(yùn)行對照品及樣品溶液，得到雙標(biāo)的實(shí)際保留時(shí)間；接著在不同色譜柱上重復(fù)上述過程，計(jì)算同一對照品在不同色譜柱的保留時(shí)間均值，即標(biāo)準(zhǔn)保留時(shí)間(standard retention time，SRT)。以SRT為縱坐標(biāo)，各色譜柱實(shí)際保留間為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入剩余組分SRT，即可得到剩余待測組分的保留時(shí)間。本研究中共有3種待測組分，因此兩兩組合進(jìn)行預(yù)測，以預(yù)測保留時(shí)間和實(shí)際測定保留時(shí)間的差值進(jìn)行比較，結(jié)果見表13。

表13 保留時(shí)間預(yù)測值的絕對偏差及與相對保留時(shí)間法的比較Tab.13 Absolute deviations of retention times predicted and comparision of results of two methods

如表所示，雙標(biāo)線性校正法的3種組合的預(yù)測結(jié)果沒有顯著性差異，鑒于獐牙菜苷對照品的價(jià)格昂貴，最終選擇以獐牙菜苦苷和龍膽苦苷作為雙標(biāo)成分。在1、2、5號色譜柱上，雙標(biāo)線性校正法和相對保留時(shí)間法的結(jié)果無顯著性差異，2種方法預(yù)測的色譜峰定位均較為準(zhǔn)確，但在3、4號色譜柱中，雙標(biāo)線性校正法的預(yù)測結(jié)果更準(zhǔn)確，與真實(shí)值之間的差異更小，且和相對保留時(shí)間法的結(jié)果存在顯著性差異，這表明雙標(biāo)線性校正法的預(yù)測結(jié)果更接近真實(shí)值，且不受對照品，色譜柱種類的限制，應(yīng)用性更強(qiáng)。

表14 一測多評法和外標(biāo)法所得結(jié)果比較Tab.14 Comparison of results obtained by QAMS method and external standard method

3 討論

3.1 內(nèi)標(biāo)選擇 在3種環(huán)烯醚萜苷中，獐牙菜苷的對照品價(jià)格昂貴，不適宜在長期大量分析實(shí)驗(yàn)中使用，龍膽苦苷對照品價(jià)廉易得，且在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其在供試品中含量大于2%，所以本實(shí)驗(yàn)選用龍膽苦苷作為內(nèi)參物。在雙標(biāo)線性校正法預(yù)測色譜峰時(shí)，選擇龍膽苦苷和獐牙菜苦苷為內(nèi)標(biāo)。

3.2 相對校正因子考察 本實(shí)驗(yàn)考察了柱溫、體積流量、色譜柱、色譜儀及檢測波長對RCF的影響，以驗(yàn)證一測多評法在新疆假龍膽質(zhì)量控制中的技術(shù)應(yīng)用性和方法重現(xiàn)性。結(jié)果表明，以上條件適度改變時(shí)相對校正因子沒有顯著性變化，表明RCF在不同條件下的重復(fù)性較理想。

3.3 色譜峰定位 針對如何準(zhǔn)確定位色譜峰的問題，本實(shí)驗(yàn)使用了相對保留時(shí)間法和雙標(biāo)線性校正法對色譜峰進(jìn)行定性，考察了單一因素柱溫、體積流量、色譜柱和色譜儀對相對保留時(shí)間的影響，結(jié)果表明雙標(biāo)線性校正法的預(yù)測結(jié)果精度高，更穩(wěn)定，允許色譜條件在一定范圍內(nèi)變動(dòng)，對色譜柱變化的容錯(cuò)率更高，該方法的技術(shù)適用性更優(yōu)，且不會(huì)顯著升高檢測成本。

綜上，本研究借助一測多評法建立新疆假龍膽3種環(huán)烯醚萜苷類活性成分的含量測定方法，結(jié)果表明該方法快速高效，操作簡便，節(jié)約了研究成本，減少了檢測試劑和耗材的消耗；重復(fù)性良好，計(jì)算得到的相對校正因子耐用性良好。通過本研究的開展，一方面有望構(gòu)建并完善藥材質(zhì)量控制體系，為藥材種屬鑒定提供參考依據(jù)；另一方面深入開展新疆假龍膽資源可持續(xù)應(yīng)用研究，對于富民興疆戰(zhàn)略的實(shí)施具有重要意義。