葛根素對多囊卵巢綜合癥大鼠糖代謝及TLR4/NF-κB信號通路的影響

董 敏，徐 敏，陳一源

(遵義醫科大學附屬醫院婦產科，貴州 遵義 563000)

多囊卵巢綜合癥是(polycystic ovary syndrome,PCOS)育齡女性常見的排卵障礙，50%的PCOS患者同時伴有不孕，是一種復雜的多基因疾病，且會受到遺傳和環境的影響，包括生活方式、飲食等。PCOS發病可能與下丘腦-垂體-卵巢軸紊亂、高雄激素血癥、高胰島素血癥、胰島素抵抗、肥胖甚至是機體炎癥相關[1]。有中醫學者認為PCOS的病機主要是來自于脾腎虧虛，肝經郁火、脾腎兩虛會導致痰血、痰濕，因此肝氣郁結、脾腎虧虛是PCOS之本，痰血、痰濕是本病之標，痰血、痰濕日久可能引起濁毒[2-3]。也有學者認為腎虛所導致的氣血失調，使卵子不能排出、卵巢增大，同時腎虛會引起痰血、痰濕，導致胰島素抵抗、高雄激素血癥等內分泌紊亂，同時引起患者肥胖、月經不調，嚴重者不孕[4]。近來有文獻表明葛根素在對抗高雄激素、脂代謝異常、胰島素抵抗、氧化應激方面有較好療效[5]，但其機制尚不明確。Guo等[6]發現調節Toll樣受體4(TLR4)使TLR4/NF-κB信號通路下調，可以抑制PCOS大鼠炎癥反應，從而改善PCOS大鼠的胰島素抵抗。郭亞東等[7]發現葛根素可以下調肥胖型高血壓患者血管內皮細胞的TLR4/NF-κB信號，從而保護血管內皮。本文旨在探討葛根素對PCOS模型大鼠糖代謝的影響，同時對TLR4/NF-κB信號通路是否參與葛根素對PCOS的治療進行研究。

1 材料與方法

1.1 動物 100只健康雌性SD大鼠，7周齡，210～230 g，購自中國科學院上海實驗動物中心，將大鼠飼養于清潔級動物房，實驗動物使用許可證號SYXK(滬)2019-0003。

1.2 試劑與藥物 脫氫表雄酮(DHEA)(美國Sigma公司，批號709549)；鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號1210010)；葛根素注射液(成都平原藥業有限公司，國藥準字H20054815，批號111034-201901)。大鼠血清中促黃體生成素(LH)ELISA試劑盒(貨號Q69170)、睪酮(T)ELISA試劑盒(貨號Q06415)、卵泡刺激素(FSH)ELISA試劑盒(貨號Q60687)(美國R&D公司)；白細胞介素6(IL-6)ELISA試劑盒(貨號ab2018113)、C反應蛋白(CRP)ELISA試劑盒(貨號ab256398)、腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA試劑盒(貨號ab46070)、HE染色試劑盒(貨號ab143166)(英國Abcam公司)；葡萄糖檢測試劑盒(上海浩然生物科技有限公司，批號910202)；RT-qPCR試劑盒(日本TaKaRa公司，AK3001)；Trizol(美國Invitrogen公司，批號10296028)。

1.3 儀器 冷動離心機(美國Thermo公司)；Gel Doc 2000型凝膠電泳儀(美國Bio-Rad公司)；PCR儀(德國Biometra公司)；光學顯微鏡(德國Leica公司)；酶標儀(美國BioTek公司)。

1.4 模型建立 取80只大鼠根據文獻[8]方法進行PCOS模型構建。配制0.6 g/kg的DHEA，每次注射前用0.2 mL大豆油稀釋后注射于大鼠頸背部皮下，每天1次。20 d后，取大鼠1個動情周期(一般連續4 d)的陰道涂片，于光學顯微鏡下觀察，若觀察到陰道上皮在此周期內持續大量角化且無核視為模型構建成功。

1.5 PCOS模型大鼠分組及干預 將最終建模成功的60只大鼠，隨機分為模型組、二甲雙胍組、二甲雙胍+葛根素組，每組20只。根據人鼠藥物劑量換算出大鼠所需藥量。二甲雙胍組灌胃給予二甲雙胍粉末(270 mg/kg)，每次灌胃前用生理鹽水溶解；二甲雙胍+葛根素組在二甲雙胍組基礎上腹腔注射100 mg/kg葛根素注射液；模型組腹腔注射等容量生理鹽水，連續給藥4周，即7個動情周期[5]，另選取20只未造模大鼠作為對照組。

1.6 監測指標 給藥4周后，禁食24 h，記錄大鼠體質量，異氟烷氣體吸入麻醉大鼠后，取腹主動脈血，離心后取血清。葡萄糖試劑盒檢測大鼠空腹血糖(FBG)，放射免疫法測量空腹胰島素(FINS)，并計算胰島素抵抗指數值(IR)[8]，公式為IR=(FBG× FINS)/22.5。第1次取血后立即灌胃給予葡萄糖，2 h后抽取尾靜脈血，檢測餐后2 h血糖(2 h PBG)。按ELISA試劑盒檢測大鼠血清中LH、T、FSH、IL-6、CRP和TNF-α水平。此外，取大鼠卵巢組織，去掉表面脂肪組織后，用4%多聚甲醛固定，乙醇逐級脫水，用石蠟進行包埋，切片厚度5 μm，最后進行HE染色，并置于顯微鏡下觀察組織形態。

1.7 RT-qPCR檢測TLR4、NF-κB及ox-LDL的mRNA表達 使用Trizol試劑盒提取卵巢組織勻漿中的總RNA，鑒定純度和完整性。用Primer 5.0軟件設計引物，見表1，按試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，并進行PCR擴增，95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，40個循環。擴增完成后進行2%瓊脂糖凝膠電泳40 min，用Gel Doc 2000型凝膠電泳進行成像和分析。GAPDH作為內參，根據灰度值計算mRNA相對表達量。

表1 大鼠TLR4、NF-κB及ox-LDL引物序列Tab.1 Primer sequences of TLR4,NF-κB and ox-LDL in rats

2 結果

2.1 葛根素對PCOS大鼠體質量的影響 如表2所示，模型組大鼠體質量高于對照組(P<0.05)；二甲雙胍組和二甲雙胍聯合葛根素組體質量低于模型組(P<0.05)，且和對照組大鼠比較無顯著差異(P>0.05)；二甲雙胍組和二甲雙胍聯合葛根素組大鼠體質量比較無顯著差異(P>0.05)。

表2 各組大鼠體質量Tab.2 Body weights of rats in each

2.2 葛根素對PCOS大鼠血清性激素水平的影響 如表3所示，與對照組比較，模型組和二甲雙胍組大鼠FSH降低(P<0.05)，LH、T水平升高(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組和二甲雙胍+葛根素組大鼠FSH水平均升高(P<0.05)，LH、T水平均降低(P<0.05)，且二甲雙胍+葛根素組大鼠作用更顯著(P<0.05)。

表3 各組大鼠血清性激素水平Tab.3 Serum levels of sex hormones of rats in each

2.3 葛根素對PCOS大鼠血糖水平和胰島素抵抗的影響 如表4所示，模型組大鼠FBG、2 h PBG、FINS水平及IR均高于對照組(P<0.05)；二甲雙胍組和二甲雙胍+葛根素組大鼠FBG、2 h PBG、FINS水平及IR均低于模型組(P<0.05)；二甲雙胍+葛根素組FINS水平和IR低于二甲雙胍組(P<0.05)。

表4 各組大鼠血糖水平和胰島素抵抗Tab.4 Blood sugar levels and IR of rats in each

2.4 葛根素對PCOS大鼠卵巢組織病理形態變化的影響 如圖1A所示，與對照組比較，模型組大鼠卵巢顆粒細胞層數較少，表面可見大小不等囊泡；二甲雙胍組顆粒細胞形態完整，排列稍亂，可見少許囊泡；而二甲雙胍組+葛根素組與對照組大鼠形態相似，顆粒細胞排列整齊且形態完整，無囊泡。對囊泡數目(圖1B)及顆粒細胞層(圖1C)統計分析顯示，與對照組比較，模型組大鼠卵巢囊泡數目增加(P<0.01)顆粒細胞層厚度減少(P<0.01)；與模型組比較，二甲雙胍組和二甲雙胍+葛根素組大鼠囊泡數目均減少(P<0.05，P<0.01)，顆粒細胞層厚度均增加(P<0.05，P<0.01)，且二甲雙胍+葛根素組作用更顯著(P<0.05)。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與二甲雙胍組比較，△P<0.05。圖1 各組大鼠卵巢形態病理形態變化Fig.1 Morphological and pathological changes of rat ovary in each

2.5 葛根素對PCOS大鼠炎性因子水平的影響 如表5所示，與對照組比較，模型組和二甲雙胍組大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組和二甲雙胍+葛根素組大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP水平均降低(P<0.05)；二甲雙胍+葛根素組大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP水平低于二甲雙胍組(P<0.05)。

表5 各組大鼠炎性因子水平Tab.5 Inflammation factors levels of rats in each

2.6 葛根素對PCOS大鼠卵巢組織TLR4、NF-κB、ox-LDLmRNA表達的影響 如表6、圖2所示，與對照組比較，模型組和二甲雙胍組大鼠卵巢組織TLR4、NF-κB、ox-LDL表達均升高(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組和二甲雙胍+葛根素組大鼠卵巢組織TLR4、NF-κB、ox-LDL表達均降低(P<0.05)；二甲雙胍+葛根素組大鼠卵巢組織TLR4、NF-κB、ox-LDL表達低于二甲雙胍組(P<0.05)。

表6 各組大鼠卵巢組織TLR4、NF-κB、ox-LDL mRNA表達Tab.6 mRNA expressions of TLR4,NF-κB and ox-LDL in ovarian tissues of rats in each

圖2 各組大鼠TLR4、NF-κB及ox-LDL mRNA表達圖Fig.2 mRNA expressions of TLR4,NF-κB and ox-LDL of rats in each group

3 討論

多囊卵巢綜合癥(PCOS)是生殖醫學領域臨床治療和研究的熱點、難點。LH的過量分泌會刺激卵巢分泌雄激素，雄激素的分泌過量和FSH的分泌過少，會卵泡發育受限，最終導致PCOS[9]。肥胖也與PCOS的發病相關，PCOS患者脂肪功能異常，脂肪組織分泌的瘦素會影響機體對胰島素的敏感性，從而導致胰島素抵抗，血糖失調，促進PCOS發展[10]。此外，有學者發現PCOS患者卵巢組織中，存在淋巴細胞和巨噬細胞的浸潤，認為PCOS可能是一種慢性炎癥。患者血液中TNF-α、CRP、IL-6水平均升高，而炎癥因子異常加重患者胰島素抵抗，導致卵泡發育障礙[11]。本研究擬從體質量、性激素水平、胰島素抵抗、炎癥因子水平這幾個方面探索治療PCOS的靶點。本研究通過DHEA皮下注射建立PCOS大鼠模型，與對照組大鼠比較，PCOS大鼠體質量增加，FSH水平降低，LH、T水平升高，從血糖和胰島素水平來看，PCOS大鼠FBG、2 h PBG、FINS、IR水平均升高，炎性因子IL-6、TNF-α、CRP水平也升高，同時大鼠卵巢顆粒細胞層數減少，表面可見大小不等囊泡，說明PCOS大鼠模型建立成功。

二甲雙胍是常見的2型糖尿病口服藥，也被用于PCOS的治療。研究表明，接受二甲雙胍治療后，PCOS患者胰島素敏感性提高，血清T、LH水平降低，FSH水平升高[12]。另有針對肥胖PCOS患者的研究發現，應用二甲雙胍后患者FINS水平下降，月經周期改善，血清T水平下降[13]。姜曉琳等[14]發現二甲雙胍用于PCOS大鼠，可以降低大鼠血清炎癥因子水平。本研究發現二甲雙胍治療組大鼠體質量下降，FSH水平升高，LH、T水平降低，血糖和胰島素水平均降低，同時炎性因子水平也降低，與文獻結果一致。

葛根素是從葛根中提取的異黃酮類衍生物，在臨床應用已超過十年。葛根素被證明可以降低血脂、胰島素抵抗和雄激素水平[15-16]。本研究聯合葛根素注射液和二甲雙胍用于治療PCOS大鼠，結果發現治療后PCOS大鼠體質量、性激素水平、胰島素抵抗、血糖水平均下降，且對降低LH、T水平，降低囊泡數量，提高顆粒細胞層厚度和改善FINS、IR作用更顯著，說明葛根素對改善卵巢形態有明顯作用。炎癥反應中，TLR4激活后，通過IL-1受體的相關激酶家族成員及磷酸化激活TGF-β活化酶，進一步激活NF-κB的上游抑制蛋白，并使IκB磷酸化降解，導致NF-κB p65入核，誘導炎癥因子的表達[17]。近來研究發現TLR4廣泛存在于組織和細胞中，TLR4激活可促進胰島素抵抗，因此調節TLR4可以改善胰島素功能[6]。Guo等[6]研究發現PCOS胰島素抵抗大鼠血清中TLR4表達升高，且TLR4/NF-κB通路被激活。PCOS是一種慢性低級別炎癥，尤其是伴隨著胰島素抵抗的患者，其體內IL-6、TNF-α表達增加。葛根素可以通過抑制NF-κB，抑制CRP、IL-6、TNF-α的表達，從而發揮保護糖尿病大鼠腎臟的作用[18]。雷凱雄等[19]發現葛根素能通過下調NF-κB和TGF-β抑制肝纖維化的發展。本研究中，葛根素和二甲雙胍聯用組對LH、T、FINS、IR、IL-6、TNF-α水平的改善作用均優于二甲雙胍單獨使用組，同時聯用組TLR4、NF-κB和ox-LDL表達低于單獨使用二甲雙胍組，說明葛根素有可能通過調控TLR4/NF-κB通路，以降低PCOS大鼠炎癥因子水平，從而達到治療PCOS、促進排卵的目的。另外ox-LDL也可以與TLR4結合，并激活NF-κB，促進炎性因子產生[20]，本研究中聯用組比單獨使用二甲雙胍組PCOS大鼠體內ox-LDLmRNA表達更低。以上結果表明，葛根素和二甲雙胍聯用能加強二甲雙胍的抗炎、降糖、降胰島素作用，而這一作用可能是通過TLR4/NF-κB通路實現的。

綜上所述，葛根素作為一種代謝快、毒性小、價格低的藥物，可以降低PCOS大鼠血糖水平、胰島素抵抗、性激素水平、炎性因子水平和ox-LDL表達，其可能是通過調控TLR4/NF-κB通路實現的。