HPLC法同時(shí)測(cè)定芩石利咽口服液中8種成分及其鎮(zhèn)咳、抗炎活性研究

石美玲，王月潔，胡朝陽(yáng)，李麗靜，鮑慧瑋

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117)

芩石利咽口服液是由黃芩、生石膏、水牛角、連翹等12味藥材組成的合劑，具有清熱解毒、疏風(fēng)利咽等作用，用于急喉痹(急性咽炎)的肺胃實(shí)熱兼外感風(fēng)邪證，為治療急性咽炎的臨床常用中成藥，但對(duì)其藥效成分的含量測(cè)定鮮有報(bào)道，而且原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅涉及黃芩苷，較為單一，難以全面有效控制其質(zhì)量。研究表明，芩石利咽口服液中黃芩所含黃芩苷[1]和漢黃芩素[2]、連翹所含連翹酯苷A[3]、赤芍所含芍藥苷[4]、皂角刺所含原兒茶酸[5]、紫蘇葉所含原兒茶醛[6]、蒲公英所含咖啡酸[7]、薄荷所含木犀草素[8]均具有抗炎作用。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定芩石利咽口服液中原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、芍藥苷、連翹酯苷A、黃芩苷、木犀草素、漢黃芩素的含量，并評(píng)價(jià)其鎮(zhèn)咳、抗炎活性，以期為該制劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 華譜S3000高效液相色譜系統(tǒng)(包括四元低壓攪拌泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、ACstation色譜工作站)；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(寧波江南儀器廠)；KQ-250型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，功率250 W，頻率40 kHz)；FA1004B型電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；AB135-S型電子分析天平 (十萬(wàn)分之一，梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司)；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑與藥物 芩石利咽口服液(吉林通化金馬藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)201912020319、202006020001、202002040001、201911010001、202007020001、10 mL/支)；川貝枇杷膏(京都念慈庵總廠有限公司，批號(hào)L11705071)；阿司匹林(沈陽(yáng)奧吉娜藥業(yè)有限公司，批號(hào)170510)。原兒茶酸(純度98%)、原兒茶醛(純度98%)、芍藥苷(純度98%)、木犀草素(純度98%)對(duì)照品(南京景竹生物科技有限公司)；漢黃芩素(批號(hào)130112)、黃芩苷(批號(hào)110715-201117，純度91.7%)、咖啡酸(批號(hào)110885-200102)、連翹酯苷A (批號(hào)111810-201606，純度93.4%)對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)。甲醇為色譜純[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；磷酸、氨水為分析純(北京化工廠)；其他試劑均為分析純；水為純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

1.3 動(dòng)物 成年雄性ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(吉)-2020-002，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性培養(yǎng)7 d。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查通過(guò)(編號(hào)2021234)。

2 成分含量測(cè)定

2.1 色譜條件 phenomenex色譜柱(250 mm×4.60 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～8 min，10%A；8～12 min，10%～20%A；12～22 min，20%A；22～30 min，20%～23%A；30～58 min，23%～31%A；58～71 min，31%～44%A；71～91 min，44%～58%A；91～94 min，58%～68%A；94～101 min，68%A；101～111 min，68%～100%A)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm(芍藥苷、黃芩苷)、254 nm(原兒茶酸)、322 nm(原兒茶醛、咖啡酸、連翹酯苷A、木犀草素、漢黃芩素)；進(jìn)樣量20 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取各對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，制得每1 mL分別含原兒茶醛0.063 9 mg、咖啡酸0.240 2 mg、連翹酯苷A 2.07 mg、木犀草素1.082 mg、漢黃芩素0.273 5 mg、原兒茶酸0.103 4 mg、芍藥苷4.563 mg、黃芩苷29.46 mg貯備液，分別精密吸取1 mL，甲醇稀釋10倍，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密量取本品5 mL，置于50 mL量瓶中，50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置于25 mL量瓶中，50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例和制備工藝，分別制備缺芍藥苷、缺漢黃芩素、缺原兒茶酸、缺原兒茶醛、缺咖啡酸、缺連翹酯苷A、缺木犀草素、缺黃芩苷的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，供試品色譜峰中呈現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰，主峰與其相鄰峰的分離度均大于1.5，各成分之間互不干擾，雜質(zhì)峰對(duì)各成分也無(wú)干擾，表明該方法專(zhuān)屬性良好。

1.原兒茶醛 2.咖啡酸 3.連翹酯苷A 4.木犀草素 5.漢黃芩素 6.原兒茶酸 7.芍藥苷 8.黃芩苷1.protocatechuic aldehyde 2.caffeic acid 3.phillyrin A 4.luteolin 5.wogonin 6.protocatechuic acid 7.paeoniflorin 8.baicalin圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1 mL，甲醇稀釋5倍，得到系列質(zhì)量濃度，分別吸取20 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得原兒茶醛、咖啡酸、連翹酯苷A、木犀草素、漢黃芩素、原兒茶酸、芍藥苷、黃芩苷峰面積RSD分別為1.13%、1.45%、0.98%、0.44%、1.34%、0.71%、1.03%、1.11%，表明儀器精密度良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品(批號(hào)201912020319)適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得原兒茶醛、咖啡酸、連翹酯苷A、木犀草素、漢黃芩素、原兒茶酸、芍藥苷、黃芩苷含量RSD分別為1.77%、1.58%、1.39%、1.80%、1.04%、1.01%、1.24%、1.55%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得原兒茶醛、咖啡酸、連翹酯苷A、木犀草素、漢黃芩素、原兒茶酸、芍藥苷、黃芩苷峰面積RSD分別為0.48%、0.93%、0.66%、1.05%、0.84%、1.02%、0.92%、0.73%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的本品6份，每份約2.5 mL，加入對(duì)照品溶液0.25 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，原兒茶醛、咖啡酸、連翹酯苷A、木犀草素、漢黃芩素、原兒茶酸、芍藥苷、黃芩苷平均加樣回收率分別為97.81%、98.56%、98.40%、98.79%、98.75%、98.08%、98.79%、98.67%，RSD分別為1.96%、1.57%、1.36%、1.48%、1.03%、1.45%、1.11%、0.84%。

2.3.7 樣品含量測(cè)定 取5批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果(μg/mL，n=3)Tab.2 Results of content determination of various constituents(μg/mL,n=3)

3 藥理活性研究

本實(shí)驗(yàn)采用氨水致小鼠咳嗽模型[9]、二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型[10]、蛋清致小鼠足腫脹模型[11]考察了芩石利咽口服液鎮(zhèn)咳、抗炎活性。

3.1 鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn) 預(yù)實(shí)驗(yàn)剔除3 min不發(fā)生咳嗽的小鼠，待穩(wěn)定5 d后，取50只隨機(jī)分為空白組、川貝枇杷膏組及芩石利咽口服液低、中、高劑量組，連續(xù)給藥1周，參考文獻(xiàn)[12]，設(shè)定劑量分別為川貝枇杷膏組0.2 mL，芩石利咽口服液低、中、高劑量組3.9、7.8、15.6 g/kg，空白組給予等體積蒸餾水。于末次給藥前12 h小鼠禁食不禁水，給藥1 h后置于自制容器中，放入含15%氨水的棉球，記錄咳嗽潛伏期(從開(kāi)始噴霧到第1次咳嗽的時(shí)間)和3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)(以腹肌收縮或縮胸、同時(shí)張大嘴為準(zhǔn)，有時(shí)會(huì)伴有咳嗽聲)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知，與空白組比較，芩石利咽口服液中、高劑量組小鼠咳嗽次數(shù)減少(P<0.05)，并且各劑量組小鼠咳嗽潛伏期延長(zhǎng)(P<0.01)。

注：A～E分別為空白組、川貝枇杷膏組及芩石利咽口服液低、中、高劑量組。與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 芩石利咽口服液對(duì)小鼠咳嗽次數(shù)(a)、咳嗽潛伏期(b)的影響Fig.2 Effects of Qinshi Liyan Oral Liquid on mouse cough frequency (a) and cough latency (b)

3.2 耳腫脹實(shí)驗(yàn) 50只小鼠隨機(jī)分為5組，連續(xù)給藥1周，末次給藥30 min后在右耳內(nèi)外兩側(cè)均勻涂布二甲苯各20 μL致耳廓腫脹，30 min后沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑6 mm的打孔器在左右兩耳同一部位打下耳片，稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算耳腫脹度、耳腫脹抑制率[13]，公式分別為耳腫脹度=右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量、耳腫脹抑制率=[(空白組平均耳腫脹度-給藥組平均耳腫脹度)/空白組平均耳腫脹度]×100%，結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知，與空白組比較，芩石利咽口服液中、高劑量組小鼠耳腫脹度降低(P<0.05)，并且耳腫脹抑制率呈量效關(guān)系。

注：A～E分別為空白組、阿司匹林組及芩石利咽口服液低、中、高劑量組。與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 芩石利咽口服液對(duì)小鼠耳腫脹度(a)、耳腫脹抑制率(b)的影響Fig.3 Effects of Qinshi Liyan Oral Liquid on mouse ear swelling degree(a) and inhibitory rate of ear swelling(b)

3.3 足腫脹實(shí)驗(yàn) 50只小鼠隨機(jī)分為5組，連續(xù)給藥7 d，末次給藥30 min后，右后足足趾部皮下注射含10%蛋清的生理鹽水，1 h后沿腳踝處剪下左右后肢，稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算足腫脹度[14]、足腫脹抑制率[15]，公式分別為足腫脹度=右足質(zhì)量-左足質(zhì)量、足腫脹抑制率=[(空白組足腫脹度-給藥組足腫脹度)/空白組足腫脹度]×100%，結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知，與空白組比較，芩石利咽口服液中、高劑量組小鼠足腫脹程度減輕(P<0.05)，并且足腫脹抑制率呈量效關(guān)系。

注：A～E分別為空白組、阿司匹林組及芩石利咽口服液低、中、高劑量組。與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 芩石利咽口服液對(duì)小鼠足腫脹度(a)、足腫脹抑制率(b)的影響Fig.4 Effects of Qinshi Liyan Oral Liquid on mouse foot swelling degree (a) and inhibitory rate of foot swelling (b)

4 討論

本實(shí)驗(yàn)分別考察了色譜柱、流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫，發(fā)現(xiàn)Phenomenex C18柱更適用于芩石利咽口服液的分析；甲醇-0.1%磷酸為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰分離效果較好，分離度較高；多波長(zhǎng)切換檢測(cè)時(shí)，具有良好的吸收，既提高效率又節(jié)約成本；柱溫為30 ℃時(shí)，柱效較高，峰對(duì)稱(chēng)性較好，各色譜峰之間實(shí)現(xiàn)基線分離。

文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道，黃芩中黃酮類(lèi)化合物具有顯著的抗炎作用，并在呼吸道炎癥等多種疾病模型中驗(yàn)證；芍藥苷為赤芍發(fā)揮抗炎作用的主要成分，能降低炎癥細(xì)胞因子和足腫脹[18-19]；連翹酯苷A為連翹藥效成分，對(duì)二甲苯所致小鼠耳部炎癥顯示出較強(qiáng)的抗炎活性[20]；原兒茶酸、原兒茶醛是急支糖漿中發(fā)揮抗炎作用的藥效成分[21]，臨床上用于質(zhì)量咳嗽痰多的復(fù)方四季青片也選用兩者作為檢測(cè)指標(biāo)[22]；咖啡酸廣泛用于治療炎癥[23]；木犀草素已被證明在多種細(xì)胞和動(dòng)物模型中表現(xiàn)出顯著的抗炎活性[24]。藥理結(jié)果表明，芩石利咽口服液可減少小鼠咳嗽次數(shù)，延長(zhǎng)咳嗽潛伏期，并對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹和蛋清致小鼠足腫脹有一定抑制作用，可能與所測(cè)8種成分相關(guān)。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測(cè)定芩石利咽口服液中原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、芍藥苷、連翹酯苷A、黃芩苷、木犀草素、漢黃芩素的含量，并評(píng)價(jià)其鎮(zhèn)咳、抗炎活性，可為進(jìn)一步完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及有效控制其質(zhì)量提供參考，也能為相關(guān)臨床治療提供理論依據(jù)。