耿錦楠，張雅青，張 煦，陸 濱

（1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，甘肅 蘭州 730030；3.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；4.蘭州市第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

食管癌（Esophageal Carcinoma，EC）是在世界范圍最常見、多發(fā)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，有調(diào)查顯示，其致死率僅次于胃癌[1-2]。該病發(fā)病有明顯地區(qū)差異，約80%的食管癌發(fā)生于發(fā)展中國(guó)家[3]。我國(guó)是EC 高發(fā)國(guó)家，尤其多見于河南、山西、河北等省份，其中食管鱗狀細(xì)胞癌（Esophageal Squamous Cell Cancer，ESCC）占EC 的90%以上[4]。該病預(yù)后較差，病情進(jìn)展至中晚期后患者的5 年生存率為10%～15%[5]。因此有必要尋找新的適用于ESCC 早期診斷及治療的分子靶點(diǎn)，以提高生存率，改善預(yù)后。LOC100130476 基因是一類位于人染色體6q23.3 的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，LncRNA），師雅斌等[6]對(duì)其在ESCC 中的表達(dá)及甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，LOC100130476 在ESCC 中呈異常低表達(dá)，可能與該病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但目前有關(guān)LncRNA LOC100130476 在ESCC中具體作用及其與預(yù)后的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。本研究采用RT-PCR 法檢測(cè)ESCC 患者癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本LOC100130476 的表達(dá)水平，進(jìn)一步探討LOC100130476 在ESCC 組織中的表達(dá)情況、與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，旨在為ESCC 的診斷和治療提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

1.1.1 一般資料 選取2014 年10 月—2016 年12 月蘭州大學(xué)第一醫(yī)院收治的食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）手術(shù)患者70 例，均取原發(fā)灶及癌旁組織（距原發(fā)灶邊緣≥5 cm）標(biāo)本，標(biāo)本留取后于30 min 內(nèi)置于液氮中并轉(zhuǎn)運(yùn)至冰箱保存，經(jīng)HE 染色確定為食管鱗狀細(xì)胞癌組織，癌旁組織未見癌細(xì)胞浸潤(rùn)。手術(shù)切除采集組織標(biāo)本后一部分于新鮮狀態(tài)下置于液氮冷藏，后入-80 ℃冰箱保存，供提取組織總RNA 及DNA，行RT-PCR 檢測(cè)；另一部分組織標(biāo)本以10%福爾馬林固定并制作蠟塊保存，行HE 染色后觀察組織形態(tài)。70 例患者中男49 例，女21 例，年齡44～80歲，平均（61.59±10.32）歲。參考2017 年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）和美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）發(fā)布的食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)（第7 版）[7]進(jìn)行分期，依據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]確定分化程度（1 級(jí)：高度分化；2 級(jí)：中度分化；3 級(jí)：低度分化）。以病歷回顧或電話隨訪等形式獲取所有患者臨床和預(yù)后資料。本研究經(jīng)蘭州大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，且患者對(duì)實(shí)驗(yàn)知情并簽署同意書。

1.1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）70 例患者經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為ESCC，行根治或姑息性切除術(shù)；（2）均為原發(fā)性食管鱗癌，術(shù)前未接受放化療治療；（3）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）食管腺癌（EAC）患者；（2）心、肝、腎等重要臟器功能不全者；（3）合并自身免疫疾病或精神疾病者；（4）并發(fā)其他惡性腫瘤者。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器、試劑 實(shí)驗(yàn)儀器：PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI 公司GeneAMP PCR）、微型離心機(jī)（賽洛捷克掌上離心機(jī)）、快速混勻器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：XK96-A 型）、低溫冷凍離心機(jī)（上海精密儀器有限公司，型號(hào)：DL-6000B 型）、冷凍存貯冰箱（青島海爾，型號(hào)：HYC-940 型）、超低溫冰箱（青島海爾，型號(hào)：DW-86L386 型）等。實(shí)驗(yàn)試劑：試劑（美國(guó)Invitrogen Life Technologies 公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司）、SYBR Real-Time PCR 試劑盒（美國(guó)Thermo 公司）、PCR 引物（上海生工技術(shù)有限公司）、蛋白酶K（美國(guó)Ambion 公司）、胎牛血清（美國(guó)BI 公司）等。

表1 RT-PCR 引物序列及擴(kuò)增條件

1.2.3 隨訪 出院后以上門和電話等形式隨訪，隨訪截止日期為2019 年12 月20 日。以手術(shù)開始至局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或末次隨訪時(shí)間定義為無病生存期（Disease Free Survival，DFS），失訪或死亡為刪失值，以手術(shù)開始至任何原因死亡或末次隨訪時(shí)間定義為總生存期（Overall Survival，OS），分析其術(shù)后生存情況。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）組織標(biāo)本HE 染色后觀察組織形態(tài)；（2）長(zhǎng)鏈非編碼RNA LOC100130476 基因在ESCC 及癌旁組織中的表達(dá)水平；（3）長(zhǎng)鏈非編碼RNA LOC100130476 基因表達(dá)與ESCC 患者臨床病理特征的關(guān)系分析；（4）長(zhǎng)鏈非編碼RNA LOC100130476 基因表達(dá)與ESCC 患者生存情況的關(guān)系分析；（5）ESCC 不良預(yù)后危險(xiǎn)因素分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 組織標(biāo)本HE 染色結(jié)果

HE 染色結(jié)果顯示，所采集腫瘤標(biāo)本均為ESCC 組織，其對(duì)應(yīng)癌旁組織無癌細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1～2）。

圖1 正常食管鱗狀上皮組織（HE 200×）

圖2 ESCC 組織（HE 200×）

2.2 LOC100130476 在ESCC 及癌旁組織中的表達(dá)水平

RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，ESCC 組織中LOC100130476 相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，其表達(dá)量（0.79±1.62）顯著低于對(duì)應(yīng)癌旁正常組織（2.89±2.77），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-5.475，P=0.000），見圖3。

圖3 LOC100130476 在ESCC 組織中表達(dá)明顯下調(diào)

2.3 LOC100130476 表達(dá)與ESCC 患者臨床病理特征的關(guān)系

ESCC 組織中LncRNA LOC100130476 表達(dá)與腫瘤分化程度、T 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 LOC100130476 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 LOC100130476 表達(dá)與ESCC 患者生存情況的關(guān)系

術(shù)后隨訪3 年，70 例患者生存29 例，占41.43%，死亡41例，占58.57%。LOC100130476 低表達(dá)組生存率低于高表達(dá)組（P＜0.05），患者DFS 和OS 均短于高表達(dá)組（P＜0.05），見表3。

表3 LOC100130476 表達(dá)與ESCC 患者生存情況的關(guān)系

2.5 危險(xiǎn)因素分析

COX 多因素回歸分析顯示，LOC100130476 表達(dá)水平是影響ESCC 不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見表4。

表4 影響ESCC 患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素

3 討論

3.1 LncRNA 通過調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展乃至浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移

LncRNA 是指長(zhǎng)度在200～100 000 nt 之間，具有調(diào)控基因表達(dá)作用非編碼RNA 分子，其不編碼蛋白質(zhì)，多以RNA 形式通過調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展乃至浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。目前人類已發(fā)現(xiàn)的LncRNA 多達(dá)11 萬種[9]，其在多種常見惡性腫瘤組織及細(xì)胞中呈異常表達(dá)（上調(diào)或下調(diào)），在ESCC 中異常表達(dá)的LncRNA 包括HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA、肌動(dòng)蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA1、前列腺癌上調(diào)長(zhǎng)鏈非編碼RNA1、肝細(xì)胞核因子1 同源異形盒反義RNA1、邊緣系統(tǒng)相關(guān)膜蛋白反義RNA3、FOXC1 基因啟動(dòng)子上游的轉(zhuǎn)錄體、尿路上皮癌胚抗原1、ENST000005479631.1 等。其中HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA 被證實(shí)在絕大多數(shù)ESCC 中呈異常表達(dá)，是癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力得以增強(qiáng)的重要驅(qū)動(dòng)因素，同時(shí)也是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10]。

3.2 LncRNA LOC100130476 基因在多種腫瘤組織中發(fā)揮抑癌基因作用

LncRNA LOC100130476 是LncRNA 的重要成員，其位于染色體6q23.3，現(xiàn)有研究證實(shí)該基因有3 個(gè)CpG 島，長(zhǎng)度分別為224、768、151 bp。師雅斌等[6]對(duì)LncRNA LOC100130476 在ESCC 中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，LOC100130476 在ESCC 組織中的表達(dá)量明顯低于正常組織，提示其可能在ESCC中發(fā)揮抑癌基因的作用。此后相繼有研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA LOC100130476 在胃賁門腺癌組織和腎細(xì)胞癌原發(fā)腫瘤組織中的表達(dá)低于對(duì)應(yīng)癌旁正常組織[11-12]，這進(jìn)一步提示LncRNA LOC100130476 可能在多種腫瘤組織中發(fā)揮抑癌基因作用，但其在ESCC 組織中的表達(dá)及導(dǎo)致其表達(dá)異常的機(jī)制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，ESCC 組織中LOC100130476 的表達(dá)顯著低于癌旁組織，提示其在ESCC 患者癌組織中表達(dá)下調(diào)，可能發(fā)揮抑癌基因作用，與既往研究結(jié)論一致[6]。更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，ESCC組織中LncRNA LOC100130476 表達(dá)與腫瘤分化程度、T 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），即低分化、T3 期和出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的ESCC 組織LncRNA LOC100130476 的表達(dá)水平相對(duì)更低，而LOC100130476 基因表達(dá)下調(diào)可能是ESCC 發(fā)生的機(jī)制之一，推測(cè)其作用機(jī)制與DNA 甲基化有關(guān)[13-15]。通常認(rèn)為在腫瘤形成過程中包含遺傳學(xué)機(jī)制和表觀遺傳學(xué)機(jī)制，這兩種機(jī)制共同影響腫瘤形成，且相互交叉存在。DNA 甲基化是表觀遺傳學(xué)常見修飾形式，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用?；騿?dòng)子區(qū)及第一外顯子區(qū)含CpG 島豐富的部位易出現(xiàn)甲基化，甲基化發(fā)生后可改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，影響DNA 構(gòu)象及穩(wěn)定性，導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，致抑癌基因表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞增殖及分化，誘發(fā)腫瘤。

3.3 LncRNA LOC100130476 基因作為抑癌基因參與了ESCC 的發(fā)生發(fā)展

既往研究證實(shí)，結(jié)腸癌中抑癌基因表達(dá)下調(diào)，而恢復(fù)其表達(dá)可致腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[16]。一方面，ESCC 中抑癌基因表達(dá)下調(diào)可能是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制；另一方面，抑癌基因可能作為判斷腫瘤患者預(yù)后的重要標(biāo)記。Fan 等[17]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)骨髓異常綜合征患者SOX7 基因啟動(dòng)區(qū)CpG 島的甲基化率（達(dá)58.1%）顯著高于正常對(duì)照組，而該病進(jìn)展至晚期后SOX7 甲基化率也顯著高于早期患者，認(rèn)為SOX7 的表達(dá)及其甲基化狀態(tài)可能作為此類患者預(yù)后預(yù)測(cè)因子。師雅斌等[6]經(jīng)研究指出ESCC 中LOC100130476 的甲基化可能是該病的特異性標(biāo)志物，采用藥物改變其第一外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)有望成為臨床治療該病的一種可行性策略。鑒于此，我們推測(cè)ESCC 組織中LOC100130476 可能也與患者預(yù)后相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，ESCC 組織中LOC100130476 低表達(dá)組生存率、DFS 和OS 均較高表達(dá)組差（P＜0.05），且其表達(dá)水平是影響患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），推測(cè)LncRNA LOC100130476 低表達(dá)可能預(yù)測(cè)ESCC 預(yù)后不良。因此LOC100130476 可能在ESCC 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，且可作為預(yù)測(cè)臨床預(yù)后的分子指標(biāo)。

3.4 LncRNA LOC100130476 基因可能是影響ESCC 預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

綜上所述，LncRNA LOC100130476 在ESCC 組織中較癌旁組織顯著下調(diào)，表達(dá)下調(diào)可能是ESCC 的發(fā)病機(jī)制之一，提示其可能作為抑癌基因參與了ESCC 的發(fā)生發(fā)展；LncRNA LOC100130476 在ESCC 組織中的表達(dá)水平是影響ESCC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究主要存在以下不足：（1）樣本量較少，未就ESCC 組織中LncRNA LOC100130476 基因甲基化狀態(tài)開展研究，這可能是闡述ESCC 組織中LncRNA LOC100130476 表達(dá)下調(diào)的重要機(jī)制；（2）ESCC 組織中LncRNA LOC100130476 表達(dá)下調(diào)的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。